Анализ азитромицина методом капиллярного электрофореза

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ  АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

(НИУ «БелГУ»)

 

 

фармацевтический факультет

Кафедра фармацевтической химии и фармакогнозии

 

 

 

АНАЛИЗ АЗИТРОМИЦИНА МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Курсовая работа

студента дневного отделения 4 курса группы 200801

Беляева Кирилла Александровича

 

 

 

Научный руководитель:

Ассистент Г.В. Васильев

 

 

 

 

 

 

 

БЕЛГОРОД 2012

 

Содержание

 

Введение…………………………………………………………………………..3

 

Капиллярный элетрофорез……………………………….......………………….4

 

Капиллярный электрофорез в  фармацевтическом анализе…………………...13

 

Анализ азитромицина (Сумамед ©) методом капиллярного электрофореза..17

 

Вывод……………………………………………………………………….…….22

 

Список использованной литературы……………………………………..…….23

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

Метод капиллярного электрофореза является одним из наиболее точных физико-химических методов и динамично развивается в настоящее время. Он сочетает в себе такие достоинства как экспрессность, универсальность, широкую возможность автоматизации анализа, высокую эффективность, экономичность одного анализа.

В настоящее  время капиллярный электрофорез не является фармакопейным методом  в РФ. Это накладывает весомые  ограничения на его использование в фармацевтическом анализе.

Анализ антибиотиков физико-химическими методами имеет  ряд преимуществ. В настоящее  время он проводится как правило с использованием систем ВЭЖХ. В данной работе изучалась возможность применения методов капиллярного электрофореза в анализе макролидов, в частности азитромицина (Сумамед ©).

Целью данного  исследования стало разработка методики анализа азитромицина на системе капиллярного электрофореза.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

- провести литературный обзор по теоретическим основам капиллярного электрофореза;

- рассмотреть  литературные данные по использованию  капиллярного электрофореза в  фармацевтическом анализе;

- разработать методику анализа азитромицина с помощью системы капиллярного электрофореза.

 

 

 

 

 

Капиллярный электрофорез

 

Метод капиллярного электрофореза стал популярным в  начале 1980-х годов благодаря работам Iorgenson и Lucas, которые продемонстрировали, что эффективность электрофореза многократно увеличивается при его проведении в кварцевых капиллярах. Эти исследования непосредственно способствовали разработке инструментального обеспечения метода. Раннее метод электрофореза из-за громоздкости и невысокой эффективности применялся в ограниченном объёме для анализа макромолекул. Введение капиллярного формата сделало возможным проводить полное количественное и автоматизированное определение не только больших молекул, но и малых (вплоть до неорганических ионов) [12].

Элетрофорезом называется движение заряженных частиц с различной скоростью в растворе электролита под влиянием электрического поля. Катионы мигрируют по направлению к отрицательно заряженному электроду (катоду), а анионы притягиваются к положительно заряженному электроду (аноду).

В случае классического  электрофореза применяются гели или полоски бумаги, пропитанные электролитами, для того чтобы уменьшить помехи, вызванные конвенкцией. Использование полиакриламидного гель-электрофореза (ПААГ-электрофореза) позволяет проводить эффективное разделение молекул ДНК и белков.

Быстрое развитие метода капиллярного электрофореза было обусловлено двумя решающими усовершенствованиями: во-первых, был существенно уменьшен внутренний диаметр капилляра; во вторых, детектирование по электропроводности, пришедшее первоначально из изотахифореза, было заменено прямым УФ-детектированием в потоке жидкости. Дальнейшее развитие метода стало возможным при использовании кварцевого капилляра с высокой прозрачностью в ближней УФ-области и равномерным внутренним диаметром от 25 до 100 мкм. При этом улучшилось как разделение, так и детектирование. Применение кварцевого капилляра позволило использовать модифицированный ВЭЖХ-детектор для определения разделяемых веществ непосредственно в капилляре. Разделение смесей происходит на капиллярных колонках длинной от 20 до 80 см.

Капиллярный электрофорез, являясь относительно молодым методом разделения и анализа, поначалу заимствовал большую часть терминов из наиболее близкого сепарационного метода — ВЭЖХ. Со временем, учитывая основной принцип разделения в КЭ — электромиграционный, была сформирована собственная терминологическая база метода капиллярного электрофореза, которая с 2002 г. рекомендована к использованию ИЮПАК [1].

 

Рисунок 1. Система капиллярного электрофореза.

 

Время миграции, t_м (migration time, t_m) — время, необходимое компоненту для прохождения им эффективной длины капилляра (L_эфф, L_eff) от зоны ввода пробы (начала капилляра) до зоны детектирования.

Электроосмотический поток, ЭОП (electroosmotic flow, EOF) — течение жидкости в капилляре под действием приложенного электрического поля. Время, необходимое жидкости для преодоления эффективной длины капилляра вследствие возникающего ЭОП, называют временем ЭОП (t_эоп, t_eof) и экспериментально определяют из электрофореграммы (electropherogram) по времени миграции нейтрального компонента — маркера ЭОП.

Подвижность ЭОП, μ_эоп (electroosmotic mobility, μ_eof) — представляет собой отношение скорости ЭОП к напряженности электрического поля. Скорость ЭОП (electroosmotic velocity, v_eof) положительна при направлении движения жидкости от входного участка капилляра к детектору и отрицательна при обратном направлении. Скорость ЭОП вычисляют как: v_эоп = L_эфф/t_эоп. Напряженность электрического поля представляет собой отношение приложенной разности потенциалов (U) к общей длине капилляра (L_общ, L_tot). Таким образом, подвижность ЭОП вычисляют из экспериментальных данных: μ_эоп = L_общ*L_эфф/t_эоп*U. Традиционно при расчете подвижностей длину капилляра выражают в сантиметрах, время миграции в секундах, а разность потенциалов в вольтах.

Электрофоретическая подвижность частицы, μ_эф (electrophoretic mobility, μ_ep) — по аналогии с предыдущей величиной представляет собой отношение электрофоретической скорости частицы к напряженности электрического поля и может быть вычислена: μэф = L_общ*L_эфф/t_м*U.

В поверхностно-немодифицированном кварцевом капилляре, заполненном  водным буферным раствором, силанольные  группы (SiOH), находящиеся на внутренней стенке капилляра, приобретают анионную форму (SiO^-). Поверность капилляра становится заряженной даже при довольно низком pH (pH=4). Катионы или растворённые вещества, имеющие частичный положительный заряд в среде буферного раствора, электростатически притягиваются к отрицательно заряженной стенке, формируя двойной электрический слой, и создают разность потенциалов на очень малом расстоянии от стенки. Создаваемый потенциал называют дзета-потенциалом. Когда к концам капилляра прикладывается напряжение, катионы, образующие двойной слой, притягиваются к катоду. Из-за того, что они сольватированы, их движение вызывает объёмное смещение раствора. Это движение основной массы раствора под действием электрического поля и называется ЭОП. Образуется типичный только для капиллярного электрофореза идеально плоский профиль ЭОП, что частично объясняет большую эффективность и разделяющую способность (более 10⁵ теоретических тарелок.)

 

 

Рисунок 2. Влияния профиля потока на ширину зоны вещества.

 

Метод капиллярного электрофореза основан на разделении заряженных компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (~2 нл) вводят в кварцевый капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером — электролитом. После подачи высокого напряжения (до 30 кВ) к концам капилляра компоненты смеси начинают двигаться с разной скоростью, зависящей, в первую очередь, от заряда и массы (точнее, величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная последовательность пиков называется электрофореграммой; качественной характеристикой вещества является время миграции, а количественной — высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества.

В приборах для  капиллярного электрофореза капилляр, заполненный раствором электролита, своими концами опущен в два содержащих тот же электролит сосуда, в которые введены электроды. Электролит должен обладать буферными свойствами, чтобы, с одной стороны, воспрепятствовать изменению состава раствора в приэлектродных пространствах, а с другой — стабилизировать состояние компонентов пробы в процессе анализа. При подаче на электроды высокого напряжения в капилляре быстро устанавливается стационарное состояние: через капилляр протекает постоянный электроосмотический поток, на который накладывается взаимно противоположная электромиграция катионов и анионов. Если в капилляр со стороны анода ввести небольшой объем раствора пробы, то ЭОП будет переносить эту зону к катоду (в область детектирования), и зона некоторое время сможет находиться в капилляре под воздействием электрического поля высокого напряжения. В течение этого времени заряженные компоненты пробы будут перемещаться в соответствии с их электрофоретическими подвижностями.

Катионные компоненты пробы, двигаясь к катоду, будут обгонять электроосмотический поток. Скорость их движения складывается из скорости ЭОП и скорости электромиграции, поэтому на выходе капилляра катионы появляются первыми и тем раньше, чем больше их электрофоретическая подвижность. Нейтральные компоненты пробы способны перемещаться только под действием электроосмотического потока, тогда как анионные будут перемещаться к аноду со скоростями меньшими, чем скорость ЭОП. Медленно мигрирующие анионы появятся на выходе после ЭОП, а те, чья скорость электромиграции по абсолютной величине превышает скорость ЭОП, будут выходить из капилляра в прианодное пространство.

 

            Рисунок 3. Система капиллярного электрофореза «Капель-105»

 

В настоящее  время известны несколько основных вариантов капиллярного электрофореза: капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) или электрофорез в свободном капиллярном потоке; мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ); капиллярное изоэлектрическое фокусирование (КИЭФ); капиллярный гель-электрофорез (КГЭ); капиллярный изотахофорез (КИТФ); капиллярная электрохроматография (КЭХ) и другие [4].

Из перечисленных  видов наиболее широкоиспользуемые виды – КЗЭ и МЭКХ.

При КЗЭ разделение проводится непосредственно в среде  электролита  и оно основано на отличиях в относительных электрофоретических  скоростях миграции индивидуальных компонентов образца. Скорость движения иона прямо пропорциональна нго электрофоретической подвижности напряженности приложенного электрического поля. Отличия в подвижности зависят от заряда и молекулярной массы анализируемого соединения в условиях конкретной методики. Значения фактической подвижности оказываются сильно зависимыми от рН и от состава буферного раствора, используемого для разделения.

В МЭКХ к используемому  буферу добавляют ионные поверхностно-активные вещества (ПАВ, чаще всего додецилсульфат натрия ДДСН) в концентрациях выше их критической концентрации мицеллообразования. Мицеллы образуют псевдонеподвижную фазу, в которой происходит разделение анализируемых веществ. Эта техника пригодна как для нейтральных так и заряженных анализируемых соединений.

Капилляр является сердцем системы КЭ, как хроматографическая колонка в ВЭЖХ.

В системах капиллярного электрофореза используют, как правило, капилляры из высокочистого плавленого кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полимерным, чаще полиимидным, защитным покрытием. В случае детектирования внутри капилляра полиимидное покрытие в зоне детектирования снимают, оставляя для прохождения света зону чистого кварца. Внутренний диаметр капилляров может варьироваться от 20 до 100 мкм, но чаще всего используют 50 и 75 мкм. Внешний диаметр составляет 365 мкм, длина капилляров 20–100 см. Различают общую (L_общ) и эффективную (L_эфф) длину капилляра: в первом случае речь идет о полной длине капилляра от входного до выходного конца, а во втором — об участке от входного конца до зоны детектирования (рис. 5).

Доминирующее  число разделений в КЭ ведут на непокрытых изнутри капиллярах, так называемых немодифицированных [1]. Их подготовка к анализу начинается, как правило, с промывки раствором щелочи для обеспечения диссоциации силанольных групп кварца и возникновения ЭОП. Тем не менее, анализ соединений, способных адсорбироваться на стенках кварцевого капилляра (например, белки, красители), или необходимость обращения ЭОП требуют использования покрытых капилляров (ковалентные покрытия или динамические).

Способы детектирования в КЭ и основные характеристики детекторов представлены в таблице [12].

 

Таблица 1. Характеристики методов детектирования применяемые в КЭ.

 

Термостатирование служит, главным образом, для отведения  Джоулева тепла. Самым простым вариантом охлаждения капилляра является сильный обдув комнатным воздухом. Кроме того, используют воздушные и жидкостные системы термостатирования капилляров, температура при этом может варьироваться от +4 до +70 °С и поддерживаться постоянной на уровне 0,1 °С. В коммерческих приборах, как правило, термостатируют только капилляры (или их часть), а в сосуде для буфера не всегда поддерживается такая же температура, как в капилляре. В ряде приборов имеется возможность термостатировать автозагрузчик пробы, что особенно полезно при анализе термолабильных образцов.

В качестве электролитов в КЭ применяются как правило  буферные системы [12]. Идеальный буфер для капиллярного электрофореза должен обладать следующими свойствами:

- достаточная буферная емкость в выбранном диапазоне рН;

- малое поглощение на длине волны детектирования;

- низкая подвижность ведущего иона.

 

 

Таблица 2. Наиболее распространенные буферные системы  в КЗЭ.

 

К достоинствам КЭ следует отнести следующее:

- высокая эффективность разделения, недоступная ВЭЖХ;

- малый объем анализируемой пробы и буферов;

- практически не требуется применение высокочистых, дорогостоящих органических растворителей;

- отсутствие колонки (старения сорбента), проблем с ее заменой;

- экспрессность и низкая себестоимость единичного анализа.

К недостаткам  КЭ относятся:

- невысокая, по сравнению с ВЭЖХ, концентрационная чувствительность определения;

- требование к анализируемым соединениям растворяться в воде и разбавленных водно-органических смесях.

 

 

 

 

 

Капиллярный электрофорез в фармацевтическом анализе

 

Обычно анализ состава лекарственного препарата  проводится физическими и химическими  методами. Такие показатели, как  подлинность, чистота, в том числе  энантиомерная, количественное определение индивидуальных компонентов лекарственных форм, с начала 1970-х годов проводили хроматографическими методами. Разделение методом КЭ отличается от типичных для хроматографии, поэтому появилась возможность альтернативного анализа при проведении этих определений. Следует отметить что КЭ в настоящее время находится в состоянии развития.

Пригодность КЭ была подтверждена многочисленными  государственными и международными инстанциями [12]. Теория метода КЭ сейчас включена в ведущие фармакопеи развитых стран. Стандартные методики КЭ успешно используются в работе Управления по контролю лекарств и пищевых продуктов США.

С помощью метода КЭ можно разделять водорастворимые  и водонерастворимые соединения, как ионизируемые так и неионизируемые.

Основные водорастворимые  лекарственные соединения разделяются  в буферных системах с низким значением  рН. При рН=2,5-5,0 даже слабоосновные  группы заряжены положительно и переносятся  к катоду, при этом ЭОП, тоже направленный к катоду, в этом случае минимален. Водонерастворимые основные вещества можно анализировать после растворения образца либо в смеси органического растворителя с водой, либо в разбавленных кислых растворах. Готовые к применению лекарственные формы, кроме основного компонента, содержат вспомогательные вещества. Для таблеток наполнителями обычно являются крахмал, тальк, магния стеарат и другие. При пробоподготовке для таблеток приходится вводить стадию центрифугирования для отделения нерастворяющихся компонентов. Сиропы содержат натрия бензоат, пропиленгликоль, глицерин, сахар. При низких значениях рН большинство добавок оказываются нейтральными, они очень медленно мигрируют со скоростью ЭОП. Таким образом, они фактически остаются во введенном объёме капилляра, не мешают разделению основного компонента и удаляются из капилляра только при последующей промывке.

Для разделения кислых лекарственных соединений используют буферные системы с рН более 7. Наиболее часто используется 10 мМ боратный буфер. При этом создается большой и стабильный ЭОП. Водонерастворимые препараты лекарственных средств, имеющие кислотные свойства, можно растворить в органических растворителях либо в водных растворах с высоким значением рН, но необходимо учитывать, что при этом некоторые соединения нестабильны (ацетилсалициловая кислота).

 

Рисунок 4. Электрофореграмма смеси цефалоспоринов.

 

В ряде работ  метод капиллярного электрофореза  используется для установления химического  состава лекарственных растений.

 

Рисунок 5. Электрофореграмма экстракта клевера.

 

Определение примесей в лекарственных препаратах имеет важное значение. Определяемые концентрации находятся в диапазоне от нескольких частей на миллиард до нескольких частей на миллион. Часто основной компонент и структурно родственные примеси имеют сходные химические свойства, что создает определенные трудности в оценке состава лекарственного средства. Явное преимущество капиллярного электрофореза перед хроматографическими методами заключается в его более высокой разделяющей способности.

 

Рисунок 6. Электрофореграмма субстанции рифампицина.

Стереоселективные лекарственные средства, как правило, сначала синтезируются как рацематы. Методу КЭ в анализе стереоселективных  соединений отводится очень важная роль, поскольку выявлены его явные  преимущества перед другими методами.

Если смесь  энантиомеров, которые необходимо разделить, добавить к оптически активной среде, то в разделяющей системе поведение  анализируемых веществ будет  столь отличным, что позволит осуществить  их разделение. Наиболее известными хиральными селекторами являются циклодекстрины [9].

 

Рисунок 7. Электрофореграмма раствора флуоксетина.

 

Для оценки качества антибиотиков в фармацевтическом анализе применяют:

- хроматографические методы (ВЭЖХ, ТСХ);

- спектроскопические методы (ИК-спектроскопия, УФ- спектроскопия);

- биологические методы; 

- химические методы.

Важнейшим методом анализа, который используется как для  идентификации, так и контроля чистоты  и количественного определения антибиотиков является ВЭЖХ [5,6]. Обычно используется обращённо-фазовый вариант ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием. Для идентификации антибиотиков также используется ТСХ и спектроскопические методы (ИК- и УФ-спектроскопия), а для количественного определения - УФ-спектрометрия. Количественное определение некоторых антибиотиков, для которых ВЭЖХ-определение затруднено, проводят микробиологическим методом.

Для установления подлинности  азитромицина используют ИК-спектроскопию, ТСХ, химическими реакциями. Испытание  на чистоту проводят методами ГЖХ  и ТСХ [5,6].

 

 

Рисунок 8. Структурная формула азитромицина.

 

Для количественного  определения используют метод ВЭЖХ. Существуют так же методики определения  биологической активности методом  диффузии в агар [5,6].

 

 

 

Анализ азитромицина (Сумамед ©) методом

капиллярного  электрофореза

 

Анализ проводился на базе лаборатории ОКК ООО «Белфармаком». В качестве оборудования была использована система капиллярного электрофореза «Капель 105М» производства фирмы «Люмекс» (г. Санкт-Петербург) под управлением ПО «Эльфоран».

Пробоподготовка включала в себя приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) из субстанции азитромицина дигидрата и приготовление раствора заданной концентрации из капсул Сумамед © 250 мг.

Для приготовления РСО использовалась субстанция азитромицина дигидрата предоставленная лабораторией ОКК «Белфармаком». Эмпирически было определено, что 10 мг азитромицина растворяются в 1 мл 0,1 М ортофосфорной кислоты. 50 мг субстанции азитромицина дигидрата было отвешено на весах аналитических весах в мерную колбу объёмом 100 мл. В колбу было добавлено 5 мл 0,1 М ортофосфорной кислоты. После нагревания на водяной бане при 70^оС 1 мин. помещению в ультразвуковую баню УЗВ-2/150-ТН на 1 мин. субстанция азитромицина дигидрата полностью растворилась. Получился прозрачный бесцветный раствор. После доведения водой очищенной до метки, произвели перемешивание. Раствор РСО имел концентрацию 0,05% азитромицина дигидрата. Раствор отобрали в виалу и произвели дегазацию на центрифуге ОПН-8 при 5 тыс. об. 5 мин.

Для приготовления анализируемого раствора использовали капсулы Сумамед © 250 мг производства фирмы «Плива» (Хорватия). Содержимое одной капсулы было помещено в мерную колбу 100 мл. В колбу было добавлено 25 мл 0,1 М ортофосфорной кислоты. После нагревания на водяной бане при 70^оС 1 мин.  помещено в ультразвуковую баню на 1 мин. Получился мутный белый раствор. Раствор был профильтрован через фильтр синяя лента, и 2 мл фильтрата перенесли пипеткой на 2 мл в мерную колбу 10 мл. После доведения водой очищенной до метки, произвели перемешивание. Анализируемый раствор имел концентрацию 0,05% азитромицина дигидрата. Раствор отобрали в виалу и произвели дегазацию на центрифуге при 5 тыс. об. 5 мин.

В качестве электролита  был использован боратный буфер  с рН=8,9. Его готовили следующим  образом. В химический стакан вместимостью 100 мл внесли 50 мл 10 мМ раствора тетрабората натрия и добавили 25 мл 10 мМ раствора борной кислоты. Раствор фильтровали через мембранный фильтр, отбросив первые 1,5 мл фильтрата, в виалу. Затем произвели дегазацию буфера на центрифуге при 5 тыс. об. 5 мин.

В процессе разработки методики использовались несколько  буферных систем. Наиболее подходящим электролитом оказался самый простой  боратный буфер. В методе КЗЭ он является одним из базовых. При попытке  использовать кислый электролит – фосфатный буфер рН=2,75 – были получены электрофореграммы, где пик азитромицина имел очень плохую симметрию и наблюдалась малая эффективность разделения. При использовании МЭКХ, электрофореграмма также огорчала.

Анализ проводили на кварцевом капилляре l=70/60 мм d=75 мкм. Температура термостатирования – 30^оС, длина волны детекции – 210 нм. Ввод пробы – гидродинамический, время ввода пробы – 15 с при давлении 30 мбар. Анализ проводился при напряжении 20 кВ без приложения дополнительного давления.

 

 

Рисунок 9. Электрофореграмма РСО азитромицина.

 

Время миграции азитромицина при анализе РСО составило 4,052 мин. Площадь пика составила 155,2.

По данным электрофореграммы  можно сделать несколько заключений. Азитромицин при движении в электрическом  поле ведёт себя как катион. Это можно заключить из того, что пик азитромицина приходится до появления маркера ЭОП на электрофореграмме [4]. Это объяснятся наличием основных центров в его молекуле. Определение азитромицина при использовании этой методики дает очень высокие показатели эффективности разделения – около 46 тысяч теоретических тарелок.

 

 

Рисунок 10. Электрофореграмма анализируемого раствора.

 

 

Время миграции азитромицина при анализе анализируемого раствора составило 3,980 мин. Площадь пика составила 157,2.

Нестабильность времени  миграции от анализа к анализу  является следствием нестабильности ЭОП, температурных эффектов, влияния  матричных и сопутствующих компонентов. Эта проблема решается введением  маркера ЭОП (например, ацетона) или  внутреннего стандарта.

Количественное содержание азитромицина рассчитывали по формуле:

 

Х = S₁ * a_o * P  * B / S_o, где

X – содержание в одной капсуле, г;

S₁ – площадь пика в анализируемом растворе;

a_o – аликвота субстанции в РСО, г;

P – коэффициент пересчёта субстанции на чистое вещество;

B – разведение;

S_o – площадь пика в растворе РСО.

 

Х = 0,231 г

Фармакопейная статья на азитромицин в капсулах 250 мг устанавливает содержание в пересчете на чистый азитромицин от 225 мг до 275 мг.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Вывод

 

Капиллярный электрофорез – высокоэффективный, экономичный  метод физико-химического анализа. Последние десятилетия происходит его широкое внедрение в такие  области, как анализ объектов окружающей среды, клиническая биохимия, криминалистика, пищевая промышленность. Не смотря на распространённость методов ВЭЖХ в фармацевтическом анализе, методы КЭ постепенно входят в ведущие фармакопеи мира и в дальшейшем ожидается рост их применения для анализа лекарственных препаратов.

Фармакопейная статья на азитромицин устанавливает как методы анализа для количественного определения ВЭЖХ и определение биологической активности.