Введение…………………………………………………………………………..2

1.Литературный  обзор…………………………………………………………..3

Классификация хроматографических методов……………………………...3

1.1.Классификация по агрегатному составу фаз…………….………………................................................................................4

А. Газовая хроматография………………………………………………………..5

Б. Жидкостная хроматография…………………………………………………...8

В. Сверхкритическая флюидная хроматография……………………………….8

1.2.Классификация  по принципу фракционирования…………………………………………………………….11

А.Адсорбционная хроматография……………………………………………...12

Б.Аффинная хроматография…………………………………………………….13

В.Гель-фильтрация………………………………………………………………16

Г.Ионообменная хроматография………………………………………………..20

Д.Распределительная  хроматография…………………………………………..24

1.3.Классификация  по расположению  неподвижной фазы……………….26

А.Колоночная хроматография…………………………………………………..26

Б.Тонкослойная хроматография………………………………………………...27 
1.4.Классификация по способу элюции……………………………………...29

А. Фронтальный анализ…………………………………………………………29

Б. Вытеснительная хроматография……………………………...……………...31

В.Бумажная хроматография…………………………………………………….32

2. Ход работы……………………………………………………………………35

2.1.Разделение красителей из растений методом бумажной хроматографии………………………………………………………………….35

3. Заключение…………………………………………………………………...37

4. Список литературы………………………………………………………….39 
 
 

Введение

     Хроматография – процесс, основанный на многократном повторении актов сорбции и десорбции  вещества при перемещении его  в потоке подвижной фазы вдоль  неподвижного сорбента. Разделение сложных смесей хроматографическим способом основано на различной сорбируемости компонентов смеси. В процессе хроматографирования так называемая подвижная фаза (элюент), содержащая анализируемую пробу, перемещается через неподвижную фазу. Обычно неподвижная фаза представляет собой вещество с развитой поверхностью, а подвижная – поток газа или жидкости, фильтрующейся через слой сорбента. При этом происходит многократное повторение актов сорбции – десорбции, что является характерной особенностью хроматографического процесса и обуславливает эффективность хроматографического разделения.

     Хроматографический  метод анализа был впервые  применён русским учёным-ботаником Михаилом Семеновичем Цветом в 1900 году. Он использовал колонку, заполненную карбонатом кальция для разделения пигментов растительного происхождения. Первое сообщение о разработке метода хроматографии было сделано Цветом 30 декабря 1901 года на XI Съезде естествоиспытателей и врачей в С.-Петербурге. Первая печатная работа по хроматографии была опубликована в 1903 году, в журнале Труды Варшавского общества естествоиспытателей. Впервые термин хроматография появился в двух печатных работах Цвета в 1906 году, опубликованных в немецком журнале Berichteder Deutschen Botanischen Gesellschaft. В 1907 году Цвет демонстрирует Немецкому Ботаническому обществу образец хроматографа — прибора для осуществления процесса хроматографии. В 1910-1930 годы метод был незаслуженно забыт и практически не развивался. В 1952 году Дж. Мартину и Р. Синджу была присуждена Нобелевская премия по химии за создание метода распределительной хроматографии. С середины 20 века и до наших дней хроматография интенсивно развивалась и стала одним из наиболее широко применяемых методов анализа.

1.Литературный  обзор

Классификация хроматографических методов

      Всем  хроматографическим методам присущи  некоторые общие характеристики, позволяющие изложить элементы их обобщенной теории. Однако необходимо рассмотреть  специфические особенности различных  вариантов хроматографического  фракционирования. Это, с одной стороны, позволит за теоретическими рассуждениями  все время видеть реальные черты  хроматографического эксперимента, а с другой — даст возможность  ввести классификацию хроматографических методов. Существует несколько  классификаций методов хроматографии: по принципу фракционирования; по способу элюции и т.д. (рис.1).

1.1.Классификация по агрегатному составу фаз

     Как ясно следует из названия, данная классификация основана на различиях в агрегатных состояниях, применяемых в хроматографии подвижных и неподвижных фаз.  В данной классификации все виды подразделяются на 3 основных вида по агрегатному состоянию используемой подвижной фазы: газовая (ГХ, GH), жидкостная (ЖХ, LH) и  сверхкритическая флюидная хроматография (подвижная фаза - полярный газ (СО₂, NH₃ и т.д.) сжатый до жидкого состояния) - что совершенно естественно, т.к. именно подвижная фаза растворяя в себе пробу  определяет спектр разделяемых и анализируемых веществ. Совершенно логичным следующим уровнем классификации является классификация по агрегатному состоянию используемой неподвижной фазы, отвечающей за взаимодействие и разделение веществ (рис.2)

А.Газовая хроматография

     Газовая хроматография (ГХ) - хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара - инертный газ (газ-носитель). Неподвижной  фазой  является  высокомолекулярная  жидкость, закрепленная на пористый носитель или на стенки длинной капиллярной трубки, или только твердое пористое вещество, заполняющее колонку, в следствие чего газовая хроматография подразделяется на газо-жидкостную и газо-твердофазную. Газовая  хроматография - универсальный  метод  разделения  смесей  разнообразных  веществ, испаряющихся  без  разложения.  При  этом компоненты  разделяемой  смеси  перемещаются  по  хроматографической колонке  с  потоком  газа-носителя. По мере  движения  разделяемая  смесь многократно распределяется между  газом-носителем (подвижной фазой) и неподвижной фазой. Принцип разделения - неодинаковое сродство веществ к летучей подвижной фазе и стационарной фазе в колонке. Компоненты смеси селективно задерживаются последней,  поскольку  сродство их  к  этой  фазе  различно,  и  таким образом разделяются (компонентам с большим сродством требуется большее время для выхода из неподвижной фазы, чем компонентам с меньшим сродством). Затем вещества выходят из колонки и регистрируются детектором. Сигнал детектора записывается в виде хроматограммы автоматическим  потенциометром (самописцем)  или же  регистрируется  компьютером (рис.3).

     Метод ГХ - один из самых современных методов многокомпонентного анализа, его отличительные черты — экспрессность, высокая точность, чувствительность, автоматизация. Метод позволяет решить многие аналитические проблемы. Количественный ГХ анализ можно рассматривать как самостоятельный аналитический метод, более эффективный при разделении веществ, относящихся к одному и тому же классу (углеводороды, органические кислоты, спирты и т.д.).

Рис 3. Пример разделения смеси газов с использованием ГХ. 

     Этот  метод незаменим в нефтехимии (бензины содержат сотни соединений, а керосины и масла - тысячи), его используют при определении пестицидов, удобрений, лекарственных препаратов, витаминов, наркотиков и др. При анализе сложных многокомпонентных смесей успешно применяют метод капиллярной хроматографии, поскольку число теоретических тарелок для 100 м колонки достигает (2—3)*10⁵. Возможности метода ГХ существенно расширяются при использовании реакционной газовой хроматографии (РГХ), вследствие того что многие нелетучие, термонеустойчивые или агрессивные вещества непосредственно перед введением в хроматографическую колонку могут быть переведены с помощью химических реакций в другие — более летучие и устойчивые. Химические превращения осуществляют чаще на входе в хроматографическую колонку, иногда в самой колонке или на выходе из нее перед детектором. Значительно удобнее проводить превращения вне хроматографа. Недостатки метода РГХ связаны с появлением новых источников ошибок и возрастанием времени анализа. Реакционную хроматографию часто используют при определении содержания микроколичеств воды. Вода реагирует с гидридами металлов, с карбидом кальция или металлическим натрием и др., продукты реакции (водород, ацетилен) детектируются с высокой чувствительностью пламенно-ионизационным детектором. К парам воды этот детектор малочувствителен. Широко применяют химические превращения в анализе термически неустойчивых биологических смесей. Обычно анализируют производные аминокислот, жирных кислот С₁₀ - C₂₀, сахаров, стероидов. Для изучения высокомолекулярных соединений (олигомеры, полимеры, каучуки, смолы и т.д.) по продуктам их разложения используют пиролизную хроматографию. В этом методе испарение пробы заменяют пиролизом. Карбонаты металлов можно проанализировать по выделяющемуся диоксиду углерода при обработке их кислотами.Методом газовой хроматографии можно определять металлы, переводя их в летучие хелаты. Особенно пригодны для хроматографированияхелаты 2-, 3- и 4-валентных металлов с b-дикетонами. Лучшие хроматографические свойства проявляют b-дикетонатыBe(II), Al(III), Sc(III), V(III), Cr(III). Газовая хроматография хелатов может конкурировать с другими инструментальными методами анализа. ГХ используют также в препаративных целях для очистки химических препаратов, выделения индивидуальных веществ из смесей. Метод широко применяют в физико-химических исследованиях: для определения свойств адсорбентов, термодинамических характеристик адсорбции и теплот адсорбции, величин поверхности твердых тел, а также констант равновесия, коэффициентов активности и др. При помощи газового хроматографа, установленного на космической станции "Венера-12", был определен состав атмосферы Венеры. Газовые хроматографы устанавливают в жилых отсеках космических кораблей: организм человека выделяет много вредных веществ, и их накопление может привести к большим неприятностям. При превышении допустимых норм вредных веществ автоматическая система хроматографа дает команду прибору, который очищает воздух. 

     Б.Жидкостная хроматография

     Жидкостная хроматография (ЖХ) - способ (метод) хроматографического разделения, в котором подвижной фазой является жидкость и разделяемые вещества находятся в постоянном равновесии между подвижной и неподвижной фазой. По типу неподвижной фазы различают: жидкостно-жидкостную, жидкостную-твердофазную и жидкостно-гелевую хроматографии).

     Сфер  применения ЖХ почти так же много, как велико количество направлений человеческой деятельности, где необходимо изучить состав различных растворов или выделить какое-либо вещество из жидкости. Практически незаменима ЖХ при определении и фракционировании высокомолекулярных лабильных соединений биологического происхождения: нуклеиновых кислот и белков. По началу, основным недостатком метода, по сравнению с ГХ, была его низкая разрешающая способность, обусловленная несколькими причинами: высокой вязкостью подвижных фаз, и, следовательно, низкой скоростью диффузии; неоднородностью подвижных фаз; ограничения в длине колонки и т.д. Но значительный прогресс в производстве высокоточных приборов (в первую очередь насосов), сорбентов и вычислительной техники привел к появлению метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сравнимого по числу теоретических тарелок с газовой хроматографией (N ~ 100000). Основным отличием ВЭЖХ отклассической колоночной ЖХ является использование мелкодисперсных (<10 mkm) сорбентов на основе жестких матриц (зачастую из силикагеля) и высоких скоростей потока. 

В.Сверхкритическая флюидная хроматография

     Сверхкритическим  флюидом (СКФ) - называют состояние вещества, при котором исчезает различие между жидкой и газовой фазой. Любое вещество, находящееся при температуре и давлении выше критической точки является сверхкритическим флюидом. Свойства вещества в сверхкритическом состоянии промежуточные между его свойствами в газовой и жидкой фазе. Так, СКФ обладает высокой плотностью, близкой к жидкости, и низкой вязкостью, как и газы. Коэффициент диффузии при этом имеет промежуточное между жидкостью и газом значение. Вещества в сверхкритическом состоянии могут применяться в качестве заменителей органических растворителей в лабораторных и промышленных процессах. Наибольший интерес и распространение в связи с определенными свойствами получили сверхкритическая вода и сверхкритический диоксид углерода (рис.4). 

Рис. 4. Фазовая диаграмма двуокиси углерода. 

     Сверхкритическая  флюидная хроматография имеет ряд преимуществ переджидкостной хроматографией и газовой хроматографией.  В ней возможно применение универсальных ПИД-детекторов¹ (в отличие от ЖХ), разделение термически нестабильных веществ и нелетучих веществ (в отличие от ГХ). На данный момент, несмотря на все преимущества, не нашла широкого применения (за исключением некоторых особых областей, таких как разделение энантиомеров и высокомолекулярных углеводородов). Несмотря на высокую чистоту получаемых соединений, высокая стоимость оборудования делает современного СКФ хроматографию применимой только в случае очистки или выделения дорогих веществ. Очень перспективна и активно внедряется СКФ хроматография, например, в медицине. В таблице приведены критические параметры и молярная масса для практически наиболее применимых веществ. 

     Одним из наиболее важных свойств сверхкритического состояния - это способность к растворению веществ. Изменяя температуру или давления флюида можно менять его свойства в широком диапазоне. Так, можно получить флюид, по свойствам близкий либо к жидкости, либо к газу. Так, растворяющая способность флюида увеличивается с увеличением плотности (при постоянной температуре). Поскольку плотность возрастает при увеличении давления, то меняя давление можно влиять на растворяющую способность флюида (при постоянной температуре). В случае с температурой зависимость свойств флюида несколько более сложная - при постоянной плотности растворяющая способность флюида также возрастает, однако вблизи критической точки незначительное увеличение температуры может привести к резкому падению плотности, и, соответственно, растворяющей способности [5]. Сверхкритические флюиды неограниченно смешиваются друг с другом, поэтому, при достижении критической точки смеси система всегда будет однофазной. Приблизительная критическая температура бинарной смеси может быть рассчитана как среднее арифметическое от критических параметров веществTc(mix) = (мольная доля A) x TcA + (мольная доля B) xTcB. Если необходима большая точность, то критические параметры могут быть рассчитаны с использованием уравнений состояния, например с помощью уравнения Пенга-Робинсона. 

     Уникальная  способность сверхкритического  флюида растворять большие объемы газа, в особенности H₂ и N₂, в купе с высоким коэффициентом диффузии, делает его использование в качестве растворителя химических реакций его чрезвычайно перспективным. Изменение температуры и давления позволяют влиять на свойства растворителя и маршрут реакции, что делает возможным более высокие выходы целевого продукта. Также следует заметить, что использование CO₂ абсолютно экологично.

1.2.Классификация по принципу фракционирования

     В любом хроматографическом процессе фигурируют неподвижная и подвижная фазы, между которыми распределяются молекулы фракционируемой смеси веществ. Под основным принципом фракционирования будем подразумевать природу физического, химического или биологического явления, обусловливающего   такое   распределение.

А.Адсорбционная хроматография

     Разделение  методом адсорбционной хроматографии  осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими, как  силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул  пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной  фазой по колонке. Достигаемое при  этом разделение зон компонентов  зависит от взаимодействия как с  растворителем, так и с адсорбентом.

     В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит  специфическое взаимодействие между  полярной поверхностью адсорбента и  полярными (или способным поляризоваться) группами или участками молекул. К таким взаимодействиям относят  диполь-дипольное взаимодействие между  постоянными или индуцированными  диполями, образование водородной связи  вплоть до образования π-комплексов или комплексов с переносом заряда. Возможным и достаточно частым в практической работе является проявление хемосорбции, которая может привести к значительному повышению времени удерживания, резкому снижению эффективности, появлению продуктов разложения или необратимой сорбции вещества.

     Изотермы  адсорбции веществ имеют линейную, выпуклую или вогнутую форму. При  линейной изотерме адсорбции пик  вещества симметричен и время  удерживания не зависит от размера  пробы. Чаще всего изотермы адсорбции  веществ нелинейны и имеют  выпуклую форму, что приводит к некоторой  асимметрии пика с образованием хвоста.

     Наибольшее  применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом пор, поверхностью, диаметром пор. Значительно  реже используют оксид алюминия и  крайне редко — другие адсорбенты, широко применяющиеся в классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого — недостаточная  механическая прочность большинства  прочих адсорбентов, не позволяющая  упаковывать их и использовать при  повышенных давлениях, характерных  для ВЭЖХ.

     Полярные  группы, обусловливающие адсорбцию  и находящиеся на поверхности  силикагеля и оксида алюминия, по свойствам  близки. Поэтомуобычнопорядок элюирования  смесей веществ и элюотропный  ряд растворителей для них  одинаковы. Однако различие химического  строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селективности — тогда предпочтение отдают тому или другому адсорбенту, более подходящему для данной конкретной задачи. Например, оксид  алюминия обеспечивает большую избирательность  при разделении некоторых многоядерных ароматических углеводородов.

     Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению  с оксидом алюминия, объясняется  более широким выбором силикагелей  по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более  высокой каталитической активностью  оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов анализа  вследствие разложения компонентов  пробы либо их необратимой хемосорбции.

Б.Аффинная хроматография

     Относительно  слабое обратимое взаимодействие между  молекулами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антителом, гормоном и рецептором и т. д. Для осуществления фракционирования по биологическому сродству, т. е. методом аффинной хроматографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его рН (рис.5).

     В большинстве случаев имеет место  не хроматографический процесс фракционирования   смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции. Впрочем, возможны варианты и истинной хроматографии, использующей явление аффинного взаимодействия. При этом фракционированию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же   аффинному   сорбенту.

     Иногда  явление биологического сродства используется только в процессе элюции. В этом случае вещество связывается с поверхностью твердого сорбента за счет ионного взаимодействия или сил адсорбции, а элюцию осуществляют путем увеличения его сродства к элюенту, куда вводят биологически родственные (в указанном выше смысле) молекулы. Такой процесс было бы точнее называть аффинной элюцией. Имеются примеры, когда один из партнеров аффинной пары имеет не биологическое происхождение, а представляет собой, например, сложный краситель, пространственная конфигурация которого имитирует какую-либо биологическую структуру.

     Аффинная  хроматография отличается чрезвычайно  высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице.

Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации.

     Одной изразновидностьюафинной хроматографии  является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ионом металла, например кадмия или никеля (никель-хелатная хроматография), и специфичеким линкером, обычно 6-10 остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (рис. 6). Особенно часто данный метод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированныеплазмиды. В результате чего молекула белка экспрессируется с присоедененнымполигистидиновым концом, за счет которого она специфичеки связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет достичь очень большой чистоты целевого продукта при минимальных затратах. Также, при необходимости возможно провести ренатурацию связанных с сорбентом белков (например обратным градиентом мочевины) после чего элюировать уже чистый биологически активный белок.

Рис. 6. Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке. Около 10 гистидиновых остатков присоединены к белку с помощью генетической инженерии, например, сочетанием сайт-специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (см. Nolting, 1999b). Гистидиновые остатки прочно связываются с гранулами, сделанными из никель-хелатирующей смолы. 

     Также возможен несколько иной вариант  аффинной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором (рис. 7).

Рис. 7. Исправление свертывания дорогих, плохо сворачивающихся, белков: шапероны, называемые также шаперонинами, прикреплены к гранулам, и развернутый или неправильно свернутый белок пропускается сквозь колонку. Шаперон взаимодействует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильнойконформации. 

В.Гель-фильтрация

     В этом простейшем варианте хроматографиимолекулы фракционируемых веществ не должны обладать никаким специальным сродством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул,— точно такой же, как и жидкость подвижной фазы, протекающей между ними. Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы. В подавляющем большинстве случаев применения гель-фильтрации для биологических целей рабочей жидкостью служат водно-солевые растворы, а материалы   гранул   гидрофильны. 

     Переход молекул вещества из подвижной фазы в неподвижную и обратно за счет диффузии ничем не затруднен. Иная ситуация складывается внутри гранул. Здесь диффузия более или менее затруднена из-за столкновений молекул диффундирующего вещества с нитями пространственной сетки полимера или стенками пор. Если размеры молекул соизмеримы со средним диаметром каналов в гранулах, то эти затруднения становятся весьма существенными и диффузия тормозится. Может сложиться и такое положение, когда часть внутреннего объема гранул, т. е. часть объема неподвижной фазы (а иногда и весь этот объем), оказывается недоступной для молекул вещества,  растворенного   в  подвижной фазе.

     Различие  степени доступности объема неподвижной  фазы для молекул различных компонентов  исходной смеси веществ является фактором, определяющим возможность  их фракционирования. Очевидно, что оно будет происходить по размерам молекул (рис. 8). Если в составе смеси имеются очень крупные молекулы, вовсе не проникающие внутрь гранул, то они будут выходить из колонки или достигать края хроматографической пластины вместе с передним фронтом подвижной фазы («фронтом элюции»). В то же время мелкие молекулы, свободно диффундирующие внутрь гранул, часть времени будут находиться в неподвижной фазе. Статистически эта часть времени одинакова для всех молекул такого размера и зависит от соотношения объемов жидкости в неподвижной и подвижной фазах. Таким образом, все мелкие молекулыдостигнут конца хроматографического пути более или менее одновременно и заведомо позднее, чем крупные. Молекулы промежуточных размеров, для которых из-за разброса значений еффективных диаметров пор внутри гранул неподвижной фазы доступна только часть ее объема, должны, очевидно, перемещаться вдоль  колонки или пластины с промежуточной скоростью.

Рис. 8. Гель-фильтрационная хроматография. Малые молекулы в образце могут проникать внутрь гранул, вследствие этого они протекают через колонку медленнее. Крупные молекулы, которые не могут проникнуть в гранулы через поры, проходят сквозь колонку быстрее, чем более мелкие. Правильный размер пор и свойства растворителя являются решающими для хорошего разделения. 

     Это явление первоначально было названо  «гель-фильтрацией», поскольку в  качестве пространственной сетки использовали полимерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем. Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин «эксклюзивная хроматография» («exclusion» — исключение; имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название — гель-фильтрация.