Клеточная инженерия

 

 

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

ФАКУЛЬТЕТ БИОТЕХНОЛОГИИ И ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

Кафедра частной зоотехнии и биотехнологии

 

КУРСОВАЯ РАБОТА

по биотехнологии

на тему: «Клеточная инженерия».

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнила : студентка  3-го курса

очного отделения   

сп. 111801.65- «Ветеринария»

Гр.322/3

Гуль Алина Сергеевна

Рецензент : доцент , к.б.н.

Сергееева Н.Н.

 

 

 

 

 

 

 

Дата сдачи на проверку

«__»___________20__г._____________

Оценка защиты__________________

Дата защиты «__»____________20__г.____________

 

 

 

 

Орел-2015

Содержание

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

Возможности, открываемые биотехнологией перед человечеством, как в области фундаментальной науки, так и во многих других областях, весьма велики и нередко даже революционны. Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое производство нужных белков, значительно облегчает технологические процессы для получения продуктов ферментации - энзимов и аминокислот, в будущем может применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения наследственных болезней человека. Клеточная инженерия и биотехнология, будучи одними из магистральных направлений научно-технического прогресса, активно способствуют ускорению решения многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая. Но особенно большие возможности биотехнология открывает перед медициной и фармацевтикой, поскольку ее применение может привести к коренным преобразованиям медицины. Многие болезни, для которых в настоящее время не существует адекватных методов диагностики и лечения (раковые, сердечнососудистые, вирусные и паразитные инфекции, нервные и умственные расстройства), с помощью генной инженерии и биотехнологии станут доступны и диагностике, и лечению. Под влиянием биотехнологии медицина может превратиться в дисциплину с ясным пониманием происходящих в организме молекулярных и генетических процессов. [1]

Целью и задачей курсовой работы является рассмотрение понятия клеточная инженерия, методы, практическое использование и значение  для общества в целом.

 

 

 

 

 

1. Клеточная инженерия. Понятие и история развития.

 

Клеточная инженерия - конструирование специальными методами клеток нового типа. Клеточная инженерия включает реконструкцию жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток, объединение целых клеток, принадлежавших различным видам (и даже относящихся к разным царствам растениям и животным), с образованием клетки, несущей генетический материал обеих клеток, и другие операции. Клеточная инженерия используется для решения теоретических проблем в биотехнологии, для создания новых форм растений, обладающих полезными признаками и одновременно устойчивых к болезням и т. п. [2]

В узком смысле слова под этим термином понимают гибридизацию протопластов или животных клеток, в широком - различные манипуляции с ними, направленные на решение научных и практических задач. Является одним из основных методов биотехнологии. [6]

Предпосылкой к развитию клеточной инженерии у человека и животных явилась разработка методов культивирования их соматических клеток на искусственных питательных средах, а также получение гибридов соматических клеток, включая межвидовые гибриды. В свою очередь, успехи в культивировании соматических клеток оказали влияние на изучение половых клеток и оплодотворение у человека и животных. Начиная с 60-х гг., в нескольких лабораториях мира были выполнены многочисленные эксперименты по пересадке ядер соматических клеток в яйцеклетки, искусственно лишенные ядер. Результаты этих экспериментов часто были противоречивы, но в целом они привели к открытию способности клеточных ядер обеспечивать нормальное развитие яйцеклеток. [3]

На основе результатов изучения развития оплодотворенных яйцеклеток в 60-е гг. были начаты также исследования по выяснению возможности оплодотворения яйцеклеток вне организма матери. Очень быстро эти исследования привели к открытию возможности оплодотворения яйцеклеток сперматозоидами в пробирке и дальнейшего развития образованных таким путем зародышей при имплантации их в матку женщины. Дальнейшее совершенствование разработанных в этой области методов привело к тому, что рождение "пробирочных" детей стало реальностью. Уже к 1981 г. в мире было рождено 12 детей, жизнь которым была дана в лаборатории, в пробирке. В настоящее время этот раздел клеточной инженерии получил большое распространение, а количество "пробирочных" детей составляет уже десятки тысяч. В нашей стране работы по получению "пробирочных" детей были начаты в 1986 г. В 1993 году была разработана методика получения монозиготных близнецов человека in vitro, путем разделения эмбрионов на бластомеры и доращивания последних до 32 клеток, после чего они могли быть имплантированы в матку женщины. [7]

Традиционно для получения более активных биологических агентов применяли селекцию и мутагенез. Селекция – это направленный отбор мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкооб-разное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции – это путь от слепого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и др. микроорганизмов. Ограничения метода селекции связано с низкой частотой спонтанных мутаций, приводящих к изменению в геноме. Ген должен удвоиться в среднем 106–108, чтобы возникала мутация. [8]

К существенному ускорению процесса селекции ведет индуцирован-ный мутагенез (резкое увеличение частоты мутаций биологического объ-екта при искусственном повреждении генома). Мутагенным действием обладают ультрафиолетовое и рентгеновское излучение, ряд химических соединений (азотистая кислота, бромурацил, антибиотики и пр.). После обработки популяции мутагеном проводят тотальный скрининг (проверку) полученных клонов и отбирают наиболее продуктивные. Проводят повторную обработку отобранных клонов, и вновь отбирают продуктивные клоны, то есть проводят ступенчатый отбор по интересующему признаку.

Работа эта требует больших трудозатрат и времени. Недостатки ступенчатого отбора могут быть в значительной степени преодолены при сочетании его с методами генетического обмена.

Генетическое конструирование in vivo (клеточная инженерия) включает получение и выделение мутантов и использование различных способов обмена наследственной информацией живых клеток.

Основой клеточной инженерии является слияние неполовых клеток (гибридизация соматических клеток) с образованием единого целого. Слияние клеток может быть полным, или клетка-реципиент может приобрести отдельные части донорской клетки (митохондрии, цитоплазму, ядерный геном, хлоропласты и др.). К рекомбинации ведут различные процессы обмена генетической информацией живых клеток (половой и парасексуальный процесс эукариотических клеток; конъюгация, трансформация и трансдукция у прокариот, а также универсальный метод – слияние протопластов). [2]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Гибридизация соматических клеток

 

В основе метода лежит слияние клеток, в результате чего образуются гетерокарионы, содержащие ядра обоих родительских типов. Образовавшиеся гетерокарионы дают начало двум одноядерным гибридным клеткам. В 1965 английский ученый Г. Харрис впервые получил гетерокарионы, образованные клетками мыши и человека. Такую искусственную гибридизацию можно осуществлять между соматическими клетками, принадлежащими далеким в систематическом отношении организмам и даже между растительными и животными клетками. Гибридизация соматических клеток животных сыграла важную роль в исследовании механизмов реактивации генома покоющейся клетки и степени фенотипического проявления (экспрессивности) отдельных генов, клеточного деления, в картировании генов в хромосомах человека, в анализе причин злокачественного перерождения клеток. С помощью этого метода созданы гибридомы, используемые для получения моноклональных (однородных) антител. [3]

Первый межвидовой гибрид при слиянии протопластов из клеток разных видов табака был получен в 1972 П. Карлсоном (США). Гибриды, полученные при слиянии протопластов, имеют важные отличия от половых гибридов поскольку несут цитоплазму обоих родителей. Возможно создание цибридов, наследующих ядерные гены одного из родителей наряду с цитоплазматическими генами обоих родителей. Особый интерес представляют цибриды растений, несущие цитоплазматические гены устойчивости к различным патогенам и стрессорным факторам от дикорастущих видов или цитоплазматические гены мужской стерильности. Слияние протопластов используют также для получения гибридов с ценными в хозяйственном отношении свойствами между отдаленными видами, которые плохо или вообще не скрещиваются обычным путем. Удалось, например, «ресинтезировать» рапс, являющийся естественным амфидиплоидом между турнепсом и капустой, получить соматический гибрид картофеля с томатами и т. д. При слиянии протопластов создают и новые клеточные линии-продуценты важных соединений. [5]

При гибридизации берут генетически маркированные штаммы микроорганизмов (чаще ауксотрофные мутанты или мутанты, устойчивые к ингибиторам роста). В результате слияния клеток (копуляции) происходит образование гибридов у дрожжей, грибов, водорослей. Если исходные клетки были гаплоидными, в результате слияния ядер появляется диплоидная клетка (зигота), несущая в ядре двойной набор хромосом. У отдельных представителей ядро сразу подвергается мейозу, в ходе которого каждая из хромосом расщепляется. Гомологичные хромосомы образуют пары и обмениваются частями своих хроматид в результате кроссинговера. Далее формируются гаплоидные половые споры, каждая из которых содержит набор генов, которыми различались родительские клетки, в результате рекомбинации генов одной и той же хромосомы, а также разных хромосом при распределении хромосомных пар. Если после слияния ядра не сливаются, образуются формы со смешенной цитоплазмой и ядрами разного происхождения (гетерокарионы). Такие формы свойственны грибам, особенно продуцентам пенициллинов. При размножении полученных гетерозиготных диплоидов или гетерокарионов происходит расщепление – проявление в потомстве, обнаруживающих не только доминантные, но и рецессивные признаки родителей. Половой и парасексуальный процесс широко используют в генетической практике промышленно важных микроорганизмов-продуцентов. [4]

У бактерий обмен генетической информацией происходит в результате взаимодействия конъюгативных плазмид (конъюгации). Впервые конъюгацию наблюдали у E. coli K-12. Для конъюгационного скрещивания культуру донора и реципиента смешивают и совместно инкубируют в питательном бульоне или на поверхности агаризованных сред. Клетки при помощи образующегося конъюгационного мостика соединяются между собой; через мостик осуществляется передача определенного сайта плазмидной хромосомы к реципиенту. Так, при 37°С для переноса всей хромосомы требуется около 90 минут. Конъюгация открыла и открывает широкие перспективы для генетического анализа и конструирования штаммов. [14]

Трансдукция – процесс переноса генетической информации от клетки реципиента к клетке-донору с помощью фага. Впервые этот процесс был описан в 1952 г. Циндером и Лидербергом. Трансдукция основана на том, что в процессе размножения фагов в бактериях возможно образование частиц, которые содержат фаговую ДНК и фрагменты бактериальной ДНК. Для осуществления трансдукции нужно размножить фаг в клетках штамма-донора, а затем заразить им клетки-реципиента. Отбор рекомбинантных форм проводят на селективных средах, не поддерживающих роста исходных форм. [9]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Метод слияния протопластов

 

В последние годы очень широко применяют метод слияния протопластов. Этот метод, видимо, является универсальным способом введения генетической информации в клетки различного происхождения. Простота метода делает его доступным для селекции промышленно важных продуцентов. Метод открывает новые возможности для получения межвидовых и межродовых гибридов и скрещивания филогенетически отдаленных форм живого. Получены положительные результаты слияния бактериальных, дрожжевых и растительных клеток. Получены межвидовые и межродовые гибриды дрожжей. Имеются данные о слиянии клеток различных видов бактерий и грибов. Удалось получить гибридные клетки в результате слияния клеток организмов, относящихся к различным царствам: животного и растительного. Ядерные клетки лягушки были слиты с протопластами моркови; гибридная растительно-животная клетка росла на средах для растительных клеток, однако, достаточно быстро утрачивала ядро и покрывалась клеточной стенкой. [11]

Достаточно успешно в последние годы проводятся работы по созданию ассоциаций клеток различных организмов, то есть получают смешанные культуры клеток двух или более организмов с целью создания искусственных симбиозов. Успешно проведены опыты по введению азотфиксирующего организма Anabaena variabilis в растения табака. Попытки введения A. variabilis непосредственно в черенки зрелых растений табака не дали положительных результатов. Но при совместном культивировании мезофильной ткани табака и цианобактерий удалось получить растения-регенеранты, содержащие цианобактерии. Получены ассоциации клеток женьшеня и паслена с цианобактерией Chlorogleae fritschii. [10]

Перспективно клональное размножение животных клеток для генетических манипуляций. Большие перспективы имеет техника клеточных культур животных клеток для получения биологически активных соединений, хотя делает пока только первые шаги. Культуры опухолевых клеток или нормальные клетки, трансформированные in vitro, сохраняют в ряде случаев способность синтезировать специфические продукты. Несмотря на много, пока не преодоленных трудностей, показана возможность получения ряда веществ в культуре животных клеток.

Важное направление клеточной инженерии связано с ранними эмбриональными стадиями. Так, оплодотворение яйцеклеток в пробирке позволяет преодолеть бесплодие. С помощью инъекции гормонов можно получить от одного животного десятки яйцеклеток, искусственно их оплодотворить in vitro и имплантировать в матку других животных. Эта технология применяется в животноводстве для получения монозиготных близнецов. Разработан новый метод, основанный на способности индивидуальных клеток раннего эмбриона развиваться в нормальный плод. Клетки эмбриона разделяют на несколько равных частей и трансплантируют реципиентам. Это позволяет размножать различных животных ускоренным путем. Манипуляции на эмбрионах используют для создания эмбрионов различных животных. Подход позволяет преодолеть межвидовой барьер и создавать химерных животных. Таким образом получены, например, овце-козлиные химеры. [12]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. Гибридомная технология

 

Наиболее перспективным направлением клеточной инженерии является гибридомная технология. Гибридные клетки (гибридомы) образуются в результате слияния клеток с различными генетическими программами, например, нормальных дифференцированных и трансформированных клеток. Блестящим примером достижения данной технологии являются гибридомы, полученные в результате слияния нормальных лимфоцитов и миеломных клеток. Эти гибридные клетки обладают способностью к синтезу специфических антител, а также к неограниченному росту в процессе культивирования.

В отличие от традиционной техники получения антител, гибридомная техника впервые позволила получить моноклональные антитела (антитела, продуцируемые потомками одной-единственной клетки). Моноклональные антитела высокоспецифичны, они направлены против одной антигенной детерминанты. Возможно получение нескольких моноклональных антител на разные антигенные детерминанты, в том числе сложные макромолекулы. [13]

Моноклональные антитела в промышленных масштабах получены сравнительно недавно. Как известно, нормальная иммунная система спо-собна в ответ на чужеродные агенты (антигены) вырабатывать до миллиона различных видов антител, а злокачественная клетка синтезирует только антитела одного типа. Миеломные клетки быстро размножаются. Поэтому культуру, полученную от единственной миеломной клетки, можно поддерживать очень долго. Однако невозможно заставить миеломные клетки вырабатывать антитела к определенному антигену. Эту проблему удалось решить в 1975 г. Цезарю Мильштейну. У сотрудников Медицинской научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии в Кембридже возникла идея слияния клеток мышиной миеломы с В-лимфоцитами из селезенки мыши, иммунизированной каким-либо специфическим антигеном. Образующиеся в результате слияния гибридные клетки приобретают свойства обеих родительских клеток: бессмертие и способность секретировать огромное количество какого-либо одного антитела определенного типа. [4]

В 1980 г. Карло М. Кроче с сотрудниками (США) удалось создать стабильную, продуцирующую антигены, внутривидовую человеческую гибридому путем слияния В-лимфоцитов миеломного больного с периферическими лимфоцитами от больного с подострым панэнцефалитом.

Основные этапы получения гибридомной техники следующие. Мышей иммунизируют антигеном, после этого из селезенки выделяют спленоциты, которые в присутствии полиэтиленгликоля сливают с дефектными опухолевыми клетками (обычно дефектными по ферментам запасного пути биосинтеза нуклеотидов – гипоксантина или тиамина). Далее на селективной среде, позволяющей размножаться только гибридным клеткам, проводят их отбор. Питательную среду с растущими гибридомами тестируют на присутствие антител. Положительные культуры отбирают и клонируют. Клоны инъецируют животным с целью образования опухоли, продуцирующей антитела, либо наращивают их в культуре. Асцитная жидкость мыши может содержать до 10–30 мг/мл моноклональных антител.

Гибридомы можно хранить в замороженном состоянии, и в любое время вводить дозу такого клона в животное той линии, от которой получены клетки для слияния. В настоящее время созданы банки моноклональных антител. Антитела применяют в разнообразных диагностических и терапевтических целях, включая противораковое лечение. [6]

Эффективным способом применения моноклональных антител в терапии является связывание их с цитоксическими ядами. Антитела, конъюгированные с ядами, отслеживают и уничтожают в макроорганизме раковые клетки определенной специфичности. [10]

 

 

 

Заключение

 

Вклад биотехнологии в сельскохозяйственное производство заключается в облегчении традиционных методов селекции растений и животных и разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельского хозяйства. Во многих странах методами генетической и клеточной инженерии созданы высокопродуктивные и устойчивые к вредителям, болезням, гербицидам сорта сельскохозяйственных растений. Разработана техника оздоровления растений от накопленных инфекций, что особенно важно для вегетативно размножаемых культур (картофель и др.). Как одна из важнейших проблем биотехнологии во всем мире широко исследуется возможность управления процессом азотфиксации, в том числе возможность введения генов азотфиксации в геном полезных растений, а также процессом фотосинтеза. Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков. Разрабатываются новые регуляторы роста растений, микробиологические средства защиты растений от болезней и вредителей, бактериальные удобрения. Генноинженерные вакцины, сыворотки, моноклональные антитела используют для профилактики, диагностики и терапии основных болезней сельскохозяйственных животных. В создании более эффективных технологий племенного дела применяют генноинженерный гормон роста, а также технику трансплантации и микроманипуляций на эмбрионах домашних животных. Для повышения продуктивности животных используют кормовой белок, полученный микробиологическим синтезом. [14]

Биотехнологические процессы с использованием микроорганизмов и ферментов уже на современном техническом уровне широко применяют в пищевой промышленности. Промышленное выращивание микроорганизмов, растительных и животных клеток используют для получения многих ценных соединений -- ферментов, гормонов, аминокислот, витаминов, антибиотиков, метанола, органических кислот (уксусной, лимонной, молочной) и т. д. С помощью микроорганизмов проводят биотрансформацию одних органических соединений в другие (например, сорбита во фруктозу). Широкое применение в различных производствах получили иммобилизованные ферменты. Для выделения биологически активных веществ из сложных смесей используют моноклональные антитела. А. С. Спириным в 1985-88 разработаны принципы бесклеточного синтеза белка, когда вместо клеток применяются специальные биореакторы, содержащие необходимый набор очищенных клеточных компонентов. Этот метод позволяет получать разные типы белков и может быть эффективным в производстве. Многие промышленные технологии заменяются технологиями, использующими ферменты и микроорганизмы. Таковы биотехнологические методы переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов, очистки и использования сточных вод для получения биогаза и удобрений. В ряде стран с помощью микроорганизмов получают этиловый спирт, который используют как горючее для автомобилей (в Бразилии, где топливный спирт широко применяется, его получают из сахарного тростника и других растений). На способности различных бактерий переводить металлы в растворимые соединения или накапливать их в себе основано извлечение многих металлов из бедных руд или сточных вод. [7]

Генная и клеточная инженерия - являются важнейшими методами (инструментами), лежащими в основе современной биотехнологии. Методы клеточной инженерии направлены на конструирование клеток нового типа. Они могут быть использованы для воссоздания жизнеспособной клетки из отдельных фрагментов разных клеток, для объединения целых клеток, принадлежавших различным видам с образованием клетки, несущей генетический материал обеих исходных клеток, и других операций.

Генно-инженерные методы направлены на конструирование новых, не существующих в природе сочетаний генов. В результате применения генно-инженерных методов можно получать рекомбинантные (модифицированные) молекулы РНК и ДНК, для чего производится выделение отдельных генов (кодирующих нужный продукт), из клеток какого-либо организма. После проведения определенных манипуляций с этими генами осуществляется их введение в другие организмы (бактерии, дрожжи и млекопитающие), которые, получив новый ген (гены), будут способны синтезировать конечные продукты с измененными, в нужном человеку направлении, свойствами. Иными словами, генная инженерия позволяет получать заданные (желаемые) качества изменяемых или генетически модифицированных организмов или так называемых «трансгенных» растений и животных. [3]

Наибольшее применение генная инженерия нашла в сельском хозяйстве и в медицине.

Таким образом, клеточная инженерия является эффективным способом модификации биологических объектов и позволяет получать новые ценные продуценты на органном и также клеточном и тканевом уровнях.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

 

1. Безбородов А. М. Биохимические основы микробиологического синтеза. – М., 2008.
2. Быков В. А., Крылов И. А., Манаков М. Н. и др. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. /Биотехнология, под ред. Н. С. Егорова и В. Д. Самуилова; т. 6. – М., 2007. 
3. Вахтин Ю. В. Генетическая теория клеточных популяций. – Л., 2007.
4. Воробева Л. И. Промышленная микробиология. – М., 2009.
5. Глеба Ю. Ю., Сытник К. М. Слияние протопластов и генетическое конструирование высших растений. – Киев, 2005.
6. Дышлюк О. С. Введение в направление. Биотехнология. – Изд-во «Лань», 2014
7. Егоров Н.С. Биотехнология проблемы и перспективы. - М., 2006
8. Мезенова О. Я. Биотехнология рационального использования гидробионтов. – Изд-во «Лань», 2013
9. Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. — М.: Наука, 2007.
10. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. – М., 2009.
11. Шамина З. Б. Генетическая изменчивость растительных клеток in vitro. - Киев, 2008.
12. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2010
13. http://www.biotechnolog.ru
14. http://www.biotechnologies.ru