1. Систематическое положение.

     Среди бактерий второй фазы нитрификации различают  три рода: Nitrobacter, Nitrospina и Nitrococcus. 

Надцарство

Царство

Группа

Подгруппа

Тип

Класс

Род

Вид 

Procaryota

Bacteria

Аэробные хемотрофные бактерии

Нитрифицирующие бактерии

Proteobacteria

Betaproteobacteria

Nitrobacter

Nitrobacter winogradskyi [4].   

2. Морфология.

     По  строению клеток исследованные нитрифицирующие  бактерии похожи, на другие грамотрицательные  микроорганизмы. У некоторых видов  обнаружены развитые системы внутренних мембран, которые образуют стопку в  центре клетки (Nitrosocystis oceanus), или располагаются по периферии параллельно цитоплазматической мембране (Nitrosomonas europaea), или образуют чашеподобную структуру из нескольких слоев (Nitrobacter winogradskyi). Видимо, с этими образованиями связаны ферменты, участвующие в окислении нитрификаторами специфических субстратов. Группа нитрифицирующих бактерий различается формой и размером клеток, способами размножения, типом жгутикования подвижных форм, особенностями клеточной структуры, молярным содержанием ГЦ-оснований ДНК, способами существования.

     Род Nitrobacter

Рис.1.форма клеток рода Nitrobacter [6].

Клетки палочковидные, грушевидные или плеоморфные.

     Подвижные или неподвижные. Движение за счет одного субтерминального или латерального жгутика. Содержит внутрицитоплазматические мембраны в виде полярных утолщенных везикул в периферической части протоплазмы. По данным электронной микроскопии тонких срезов клеточная стенка отличается от таковой большинства грамотрицательных бактерий. Она состоит из трех слоев (электроноплотный, электронопрозрачный, электороноплотный), причем внутренний слой более электроноплотный, чем наружный. Клетки, выращенные литоавтотрофно или миксотрофно, всегда содержат карбоксисомы. Дополнительные включения-гранулы поли-β-гидроксибутирата и полифосфаты. Факультативные литоавтотрофы. Основным источником энергии служит нитрит. Возможен миксотрофный рост. В присутствии нитрита и органических веществ часто происходит двухфазный рост: сначала клетки используют нитрит, а затем, после лаг-фазы, окисляют органическое вещество. Хемоорганотрофный рост медленный и несбалансированный, с накоплением больших количеств гранул  поли-β-гидроксибутирата, искажающих форму и размеры клеток. Один штамм получает энергию путем окисления оксида азота до нитрата ( Freitag, Bock, FEMS, Microbiol. Lett.). Все наземные (почвенные и пресноводные) бактерии, окисляющие нитрит, относятся исключительно к роду Nitrobacter. Виды, распространенные в океанах, обычно облигатно галофильные.

     Типовой тип: Nitrobacter winogradskyi.

     Дифференциация  видов рода Nitrobacter: Типовой вид невозможно отличить от видов: «N. hamburgensis» и «N. vulgaris» без анализа генотипических показателей, таких как содержание G+С в ДНК или состава клеточных белков; в связи с этим идентификацию до вида желательно проводить в специализированных лабораториях.  
 

     Род Nitrospina 

Рис. 2.Форма клеток рода Nitrospina [6].

     Тонкие  палочки. В стационарной фазе роста  и в старых культурах часто  присутствуют сферические формы  диаметром 1,4-1,5 мкм. Неподвижные. Системы  внутрицитоплазматических мембран  отсутствуют, но иногда при электронной  микроскопии тонких срезов видны  инвагинации цитоплазматической мембраны.

     Типовой (и единственный) вид: Nitrospina gracilis.

     Признаки  вида: Как для рода. 
 
 
 

     Род Nitrococcus 

Рис.3.Форма клеток рода Nitrococcus [6].

     Клетки  сферические. Одиночные клетки перед бинарным делением слегка удлиняются. После деления располагаются парами. Подвижные за счет оного или двух жгутиков. Внутрицитоплазматические мембраны в виде трубочек, расположенных по всей цитоплазме. Содержат карбоксисомы. Аэробы; облигатные хемолитоавтотрофы. Мезофиллы. Основной способ получения энергии для роста- окисление нитрита до нитрата. Основной источник углерода- СО2. облигатные галлофилы. Для роста оптимальна среда на основе 70-100% морской воды. Выделены только из морской среды.

     Типовой (и единственный) вид: Nitrococcus mobilis.

     Признаки  вида: Как для рода. 
 
 
 

3. Особенности жизнедеятельности.

     3.1.Питание. Нитрифицирующие бактерии обнаружены в водоемах разного типа и в почвах, где они, как правило, развиваются совместно с бактериями, жизнедеятельность которых приводит к образованию исходного субстрата нитрификации — аммиака.

     Основным  источником энергии служит нитрит. Для рода Nitrobacter возможен миксотрофный рост. В присутствии нитрита и органических веществ часто происходит двухфазный рост: сначала клетки используют нитрит, а затем, после лаг-фазы, окисляют органическое вещество. Хемоорганотрофный рост медленный и несбалансированный, с накоплением больших количеств гранул  поли-β-гидроксибутирата, искажающих форму и размеры клеток. Один штамм получает энергию путем окисления оксида азота до нитрата ( Freitag, Bock, FEMS, Microbiol. Lett.).

     Все нитрифицирующие бактерии — облигатные аэробы, т.е. живут на поверхности  среды, которая соприкасается с  воздухом.; некоторые виды — микроаэрофилы. Большинство — облигатные автотрофы, рост которых ингибируется органическими соединениями в концентрациях, обычных для гетеротрофов. С использованием 14C-соединений показано, что облигатные хемолитоавтотрофы могут включать в состав клеток некоторые органические вещества, но в весьма ограниченной степени. Основным источником углерода остается CO₂, ассимиляция которой осуществляется в восстановительном пентозофосфатном цикле. Только для некоторых штаммов Nitrobacter показана способность к медленному росту в среде с органическими соединениями в качестве источника углерода и энергии.

     3.2. Дыхание. Все известные нитрифицирующие бактерии являются облигатными аэробами. Кислород необходим им как для окисления аммония в азотистую кислоту:

      так и для  окисления азотистой кислоты  в азотную:

      Вторая фаза нитрификации сопровождается потерей 2 электронов. Окисление нитрита  до нитрата, катализируемое молибденсодержащим ферментом нитритоксидазой, локализовано на внутренней стороне ЦПМ и происходит следующим образом:

     NO₂^-+ H₂O→  NO₃^- + 2H⁺ + 2.

     Электроны поступают на цитохром  и через цитохром c на терминальную оксидазу где акцептируются молекулярным кислородом. При этом происходит перенос через мембрану 2H⁺. Поток электронов от NO₂^- на O₂ происходит с участием очень короткого отрезка дыхательной цепи. Восстановитель образуется в процессе энергозависимого обратного переноса электронов. Большая нагрузка на конечный участок дыхательной цепи объясняет высокое содержание цитохромов c и a у нитрифицирующих бактерий.Когда окисляется нитрит, то включение его электронов в цепь, вероятно, идет на уровне либо цитохрома типа с, либо цитохрома типа a. В связи с этой особенностью большое значение у нитрифицирующих бактерий имеет так называемый обратный, или обращенный, транспорт электронов, идущий с затратой энергии части АТФ или трансмембранного потенциала, образуемых при передаче электронов на кислород(рис.4).

     Рис.4. Цепь переноса электрона при окислении нитрита у Nitrobacter winogradskyi [6].

     Таким образом происходит обеспечение хемоавтотрофных нитрифицирующих бактерий не только АТФ, но и НАДН, необходимых для усвоения углекислоты и для других конструктивных процессов.

     3.3. Размножение. Как показано Г. А. Заварзиным, размножение Nitrobacter происходит путем почкования-  тип бесполого размножения, при котором дочерние особи формируются из выростов тела материнского организма (почек). 

Рис.5. Схема размножения почкованием [6].

Причем дочерняя клетка бывает обычно подвижна, так  как снабжена одним латерально расположенным жгутиком. Отмечают также сходство Nitrobacter с почкующимися бактериями рода Hyphomicrobium по составу жирных кислот, входящих в липиды [5]. 
 
 
 
 
 
 

4. Экология  микроорганизмов.

     4.1. Действие факторов  среды. Нитрификаторы чувствительны к кислой среде. Область значений рН, при которой наблюдается рост разных видов и штаммов нитрифицирующих бактерий, приходится на 6,0-8,6, а оптимальное значение рН чаще всего 7,0-7,5. Известны штаммы, имеющие температурный оптимум при 26 или около 40 °C, и штаммы, довольно быстро растущие при 4 °C.

     Все известные нитрифицирующие бактерии являются облигатными аэробами.

     4.2. Экологическое значение.  Хемоавтотрофные нитрифицирующие бактерии имеют широкое распространение в природе и встречаются как в почве, так и в разных водоемах. Осуществляемые ими процессы могут происходить весьма в крупных масштабах и имеют существенное значение в круговороте азота в природе. Раньше считали, что деятельность нитрификаторов всегда способствует плодородию почвы, поскольку они переводят аммоний в нитраты, которые легко усваиваются растениями, а также повышают растворимость некоторых минералов. Сейчас, однако, взгляды на значение нитрификации несколько изменились. Во-первых, показано, что растения усваивают аммонийный азот и ионы аммония лучше удерживаются в почве, чем нитраты. Во-вторых, образование нитратов иногда приводит к нежелательному подкислению среды. В-третьих, нитраты могут восстанавливаться в результате денитрификации до N₂, что приводит к обеднению почвы азотом.

     Размеры гетеротрофной нитрификации в некоторых  случаях бывают довольно большие. Кроме  того, при этом образуются некоторые  продукты, обладающие токсичным, канцерогенным, мутагенным действием и соединения с химиотерапевтическим эффектом. Поэтому исследованию данного процесса и выяснению его значения для гетеротрофных микроорганизмов сейчас уделяют значительное внимание. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

5. Промышленное  значение.

     Тимоти  Хованеком была открыта роль нитрит-окисляющих бактерий Nitrospira в аквариумах.

     Исследования  длились около пяти лет. За это  время в научной литературе появились  работы других исследователей, которые  демонстрировали, что Nitrospira-подобные бактерии являются доминирующими нитрит-окислителями и в установках по обработке сточных вод.

     Эти исследования также показали, что  выводы о доминирующей роли бактерий Nitrosomonas europaea в окислении аммиака ошибочны. Использование методов молекулярной биологии позволило выяснить, что в установках по переработке сточных вод преобладают, в основном, 3 группы аммиак-окисляющих бактерий. Бактерии, родственные Nitrosomonas europaea; Nitrosococcus mobilis и родственные бактерии; и третья группа – не-известные бактерии, которые не удалось идентифицировать и культивировать. Численно преобладающими оказались бактерии Nitrosococcus mobilis. [www/delivery/ck.php]

     Нитрификаторы как удобрения.

     Для синтеза белков растениям необходим  азот. Азотсодержащие минеральные удобрения  подразделяются на аммиачные, нитратные и амидные. Нитратная группа удобрений- селитры: натриевая NaNO3, калиевая KNO3 и кальциевая Ca(NO3)2

     Недостаток  удобрений в следующем: они взаимодействуют  с водой постепенно, поэтому и  питательные вещества поступают  из них к растениям также постепенно. К микробам, использующим энергию, освобожденную  при окислении минеральных веществ, относятся также бактерии-нитрификаторы. Они способны превращать аммиак в селитру. Эти бактерии, создают органические вещества из воды, углекислого газа и минеральных солей. Нитрификаторы, как и серобактерии, не нуждаются в солнечной энергии. Их можно встретить даже в бесплодных песках, в трещинах скал, в темных ущельях, лишенных каких-либо признаков жизни. В природных условиях они образуют огромное количество селитры из аммиака, выделяющегося при разложении животных и растительных остатков. В хорошо проветриваемой почве за год может быть образовано на гектаре более четверти тонны селитры — ценного азотного удобрения. В некоторых местах, где растительность скудна или ее совсем нет, а дождей почти не бывает, накапливающаяся селитра не вымывается из почвы. Здесь образуются залежи селитры.

     Энергия, выделяющаяся при окислении аммиачного азота до нитратного, используется бактериями для ассимиляции углекислого  газа и для других эндотермических  процессов.

     Существуют  другие бактерии и грибки, которые  проводят нитрификацию не только аммиачного азота, но и азота органических соединений, осуществляя таким образом минерализацию органических соединений, попавших в почву. В результате действия различных нитрифицирующих бактерий аммиак и органические амины, содержащиеся в больших количествах в навозе, превращаются в нитраты. Последние попадают в грунтовые воды, водоёмы и колодцы. Вследствие этого вода колодцев, расположенных вблизи больших ферм, часто содержит недопустимо большое количество нитратов и потому непригодна для питья и приготовления пищи. Поэтому использование удобрений небезопасно в экологическом плане.

     Опасность заключается не в самих нитратах, а в продуктах их восстановления - нитритах. Нитриты образуются из нитратов в желудке как человека, так и животных. Они-то и обладают ядовитым действием на организм. Кроме того, нитриты способны нитрозировать аминные группы в белках и аминокислотах, приводя к образованию нитрозаминов. Существуют указания на то, что некоторые из нитрозаминов обладают канцерогенными свойствами.

     Таким образом, мы показали, что использование  азотных удобрений, хотя и эффективно, представляет из себя вопрос дискуссионный из-за экологической небезопасности [3]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

6. Методы  исследований

     Нитрифицирующие бактерии являются грамотрицательными.

     Окраска по Граму. Универсальный дифференциаль¬но-диагностический   метод   окраски.   По   отношению   к окраске по Граму все виды микробов принято делить на две группы:  грамположительные и     грамотрицательные.

     Метод окраски по Граму основан на использовании способности магниевых солей рибонуклеиновой кислоты, содержащихся   в   цистоплазме   целого   ряда   микробов (грамположительных), вступать в реакцию с генцианвиолетом и йодом и образовывать стойкое соединение,  не разрушающееся при последующем воздействии спирта. Грамотрицательные микробы, имеющие иной   состав   цитоплазмы,   прочного  соединения  с генцианвиолетом   не   образуют  и при обработке спиртом обесцвечиваются, а при дополнительной окраске водным раствором   фуксина   окрашиваются   в   розово-красньй цвет.

     Техника  окраски по  Граму заключается в следующем:  На обычно приготовленный и фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги  (несколько короче предметного стекла)   и на нее наливают  раствор генцианвиолета   на 2 мин. Затем бумагу удаляют, краску сливают и на препарат наливают люголевский раствор на 2 мин. (мазок чернеет).  Сливают люголевский раствор и обрабатывают 96-градусным спиртом 30 с. Промывают водой и дополнительно окрашивают фуксином Пфейффера 2 мин.  Промывают водой, высушивают и микроскопируют.

     Грамположительные   микробы   окрашиваются в темно-фиолетовый, почти черный цвет, грамотрицательные  — в розово-красный.

     Нитрфикаторы в своем строении имеют жгутики.

     Для обнаружения жгутиков у бактерий имеются различные методы. По Пешкову, жгутики окрашивают в три этапа. Под¬готовка заключается в том, что из 18-часовой агаровой культуры петлей берут немного материала и помещают в пробирку с 5—6 мл водопроводной воды. После того как из культуры образуется равномерная суспензия (без перемешивания), каплю ее наносят на часовое стекло и прибавляют каплю 2%-ного раствора осмиевой кислоты.

     Чистое  покровное стекло фламбируют над пламенем горелки, наносят на него пастеровской пипеткой 5 маленьких капель (од¬ну в центре и четыре по углам) и оставляют их на несколько минут для высыхания. Затем препарат протравливают-—-зали¬вают протравой, которую готовят следующим образом. Смеши¬вают 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина и 10 мл 20%-ного.водного раствора танина. К этой смеси до¬бавляют 5,5 мл насыщенного водного раствора соли Мора и оставляют на сутки. Перед употреблением протраву фильтруют. После 15-минутного травления протраву смывают в течение 30 сек сильной струей дистиллированной воды до полного ее удаления. Протравленный препарат помещают мазком вниз на часовое стекло и заливают разбавленным карболовым фукси¬ном Циля, который действует на препарат в течение 2—5 мин. Затем препарат промывают водой, сушат и просматривают все пять капель.

     Подвижность также можно обнаружить методами висячей и раздавленной капли.

     Спор  не образуют.

     На  процессы окисления влияют не только микробы, но и их ферменты. Кроме  органического вещества на нитрификацию оказывает влияние концентрация аммиака. Его действие на культуру резко  проявляется в условиях в условиях жидких сред. В почве же аммиак находится в адсорбированном состоянии и не может оказывать угнетающего действия. Поэтому Nitrobacter сразу же окисляет азотистую кислоту в азотную.

     Нитрифицирующие бактерии растут на простых минеральных  средах, содержащих окисляемый субстрат в виде аммония или нитритов и  углекислоту. Источником азота в  конструктивных процессах могут  быть, кроме аммония, гидроксиламин и нитриты.

       Для их роста неблагоприятно  присутствие в среде органических  веществ, таких, как пептон, глюкоза,  мочевина, глицерин и др. Сильная  чувствительность нитрифицирующих  микробов к органическим веществам  отмечается в растворах, в почве  этого не наблюдается, так как  в ней водорастворимых веществ  в значительных количествах не  бывает.

     Отрицательное действие органических веществ на хемоавтотрофные  нитрифицирующие бактерии неоднократно отмечалось и в дальнейшем. Сложилось  даже мнение, что эти микроорганизмы вообще не способны использовать экзогенные органические соединения. Поэтому их стали называть «облигатными автотрофами». Однако в последнее время показано, что использовать некоторые органические соединения эти бактерии способны, но возможности их ограничены. Так, отмечено стимулирующее действие на рост Nitrobacter в присутствии нитрита дрожжевого автолизата, пиридоксина, глутамата и серина, если они в низкой концентрации вносятся в среду.

     Недавно установлено также, что некоторые  штаммы Nitrobacter растут на среде с ацетатом и дрожжевым автолизатом не только в присутствии, но и в отсутствие нитрита, хотя и медленно. При наличии нитрита окисление ацетата подавляется, но включение его углерода в разные аминокислоты, белок и другие компоненты клеток увеличивается. Имеются, наконец, данные, что возможен рост Nitrosomonas и Nitrobacter на среде с глюкозой в диализируемых условиях, которые обеспечивают удаление продуктов ее метаболизма, оказывающих ингибиторное действие на данные микроорганизмы. На основании этого делается вывод о способности нитрифицирующих бактерий переключаться на гетеротрофный образ жизни. Однако для окончательных выводов необходимо большее число экспериментов. Важно прежде всего выяснить, как долго нитрифицирующие бактерии могут расти в гетеротрофных условиях при отсутствии специфических окисляемых субстратов.

                                                                  [4].

7. Литература

1. Асонов Н.Р. Микробиология. М.: Колос,2002, с.145-147.

2. Шлегель Г.  Общая микробиология М.: Мир, 1987, с. 349-352, 504, 523.

3. Под редакцией  Егорова Н.С. Промышленная микробиология  М.: Просвещение,1989, с. 338-353.

4. Берджи. Определитель бактерий. В 2-х томах. М.: Мир, 1998, с. 357-358, 456.

5. Мишустин Е.Н., Емцев В.Т. Микробиология. М.: Колос, 1978, с.162-164 

6. http//www.microdigitalworld.ru//