Penicillium griseofulvum продуцент антибіотика гризеофульвіну

МІНІСТЕРСТВО  ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ  УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

 

Кафедра біотехнології  і мікробіології

 

 

 

Курсовий проект

 

 

З дисципліни «Основи наукових досліджень»

на тему «Penicillium griseofulvum продуцент антибіотика гризеофульвіну»

 

 

 

 

 

 

Виконав студент  групи БТЕК - ІІІ - 3                        Кістенюк Н.С.

Керівник, канд. біол. наук.                                            Скроцька О.І.

 

 

 

Київ 2013 р.

 

ЗМІСТ

РЕФЕРАТ………………………………………………………………….4

ВСТУП……………………………………………………………………. 6

АНАЛІТИЧНИЙ ОГЛЯД  ЛІТЕРАТУРИ

РОЗДІЛ 1. Значення антибіотиків у життєдіяльності  людини……………...8

1.1. Вплив гризеофульвіну на біохімічні процеси в організмі………....8

1.2. Галузі застосування та потреба на ринку гризеофульфіну ………..9

РОЗДІЛ 2. Порівняльна  характеристика методів одержання і промислових способів виробництва гризеофульвіну…………………………………….…11

2.1. Мікробіологічний синтез гризеофульвіну……..…………………..11

2.2. Хімічний синтез гризеофульвіну ……………………………….….12

2.3. Вплив основих параметрів та фізико - хімічний вплив одержання гризеофульвіну ……………………………………..…………………………14

ТЕХНОЛОГІЧНА  ЧАСТИНА РОБОТИ

РОЗДІЛ 3. Характеристика кінцевого продукту − антибіотика гризеофульвіну..………………………………………………………………..16

РОЗДІЛ 4. Обгрунтування  вибору технологічної схеми ………………..…..18

4.1. Обгрунтування способу проведення біосинтезу……… …………..18

4.2. Обгрунтування вибору біологічного агента для синтезу гризеофульвіну…….….......................................................................................20

4.3. Обгрунтування вибору складу поживного середовища для культивування Penicillium griseofulvum ……………………………………...23

4.4. Розрахунок складу поживного середовища для культивування Penicillium griseofulvum …………………………………………………….…24

4.5.Обгрунтування  вибору ферментаційного обладнання……………..28

РОЗДІЛ 5. Характеристика Penicillium griseofulvum …………………....…..34

5.1. Морфолого-культуральні ознаки…………………………...…….....34

5.2. Фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента .............................35

5. 3. Таксономічний статус біологічного агента……………………....….36

5. 4. Схема біотрансформації  ростового субстрату……………………..37

5. 4. 1. Шляхи біоснтезу антибіотика гризеофульвіну з глюкози та

лактози ……………………………………….…………………………….37

РОЗДІЛ 6. Опис технологічного процесу біосинтезу гризеофульвіну ……...39

6.1. Підрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу…….39

6.2. Опис технологічного процесу………………………………………..39

6.3. Контроль  виробництва………………………………………………..53

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ……………..…………..…..66

 

 

 

 

Реферат

Робота присвячена виробництву антибіотика гризеофульвіну, який виділений із Penicillium griseofulvum. Гризеофульвін – протигрибковий антибіотик широкого спектру дії, який може використовується у медицині, рослинництві та ветеринарії. Культивування проходить при t = 28 °С,           pH = 6,8 - 7,2, аерація близько одиниці. Робота складається зі вступу, 6 розділів та списку використаної літератури із 27 найменувань. Загальний обсяг роботи 61 сторінки,7 рисунків,1 таблиця, 3 креслень формату А2.

У роботі дано обґрунтування  та викладено технологічний процес ділянки біосинтезу виробництва препарату, який включає блок допоміжних робіт та стадії вирощування культури

Ключові слова: Penicillium griseofulvum, гризеофульвін, технологічна схема, допоміжні роботи, виробничий процес, поживне середовище, біологічний агент, антибіотики, лікарський засіб.

 

Перелік умовних  позначень

АТФ – аденозинтрифосфорна  кислота

ДСТУ – державний  стандарт України

ДР – допоміжні  роботи

ЗВ – знешкодження відходів

КТ – контроль технологічний

КМ – контроль мікробіологічний

НАДН – нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат

НАДФН – нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат відновлений

ТП – технологічний  процес

ТУ – технічні умови

 

Вступ

Друга половина ХХ століття характеризувалася помітним зростанням рівня захворюваності на мікози. Широкого територіального поширення набула низка грибкових інфекцій, зокрема дерматофітій, що можна пояснити інтенсивною міграцією населення та зміною способу життя в індустріальних країнах. Це зростання не вдалося зупинити і після впровадження новітніх фармацевтичних засобів. За даними ВООЗ, кожний п’ятий житель землі інфікований грибками, а кожний десятий має виражені клінічні прояви грибкових інфекцій. Частота ураження населення європейських країн мікотичними інфекціями становить від 20 до 70 % [11]. Незважаючи на очевидні успіхи та досягненя медицини, кількість таких хворих кожного року стрімко зростає.

Аналогічна ситуація склалася і в Україні. Актуальність проблеми грибкових захворювань у Київський  області обумовлена високим рівнем і неухильним зростанням дерматофітів серед населення. За даними статистичної звітності у 2012 році було зареєстровано, порівняно з попередніми роками захворюваність грибковими інфекціями, значно більше хворих на 10 − 12 %, а за останнє десятиліття частота мікозів серед онкологічних хворих зросла до 25 % [10, 11].

Актуальністю  проекту є застосування антибіотика широкого спектру дії гризеофульвіну – це хлорвмісний антибіотик, продукт біосинтезу цвілевих грибів Penicillium griseofulvum, який добре зарекомендував себе в лікуванні проти збудників мікозу шкіри, волосся, нігтів: трихофітія, фавус, мікроспорія волосистої частини голови, гладкої шкіри, дерматомікоз бороди і вусів, епідермофітія гладкої шкіри, епідермофітія стоп, пахова епідермофітія, оніхомікози, трихофітії. Також гризеофульвін діє проти ракових клітин. За останні роки було розроблено виробництво гризеофульфіну у різних лікарських формах, у зв'язку з широким застосуванням антибіотика на практиці. Користується популярністю препарат у ветеринарії та рослинництві [2, 29].

Великою перевагою  антибіотику є те, що він підходить  для лікування дітей та не має побічних ефектів. Препарат швидко всмоктується та забезпечує оптимальну концентрацію препарату в організмі протягом тривалого часу [2].

Новизною  проекту є використання штаму Penicillium griseofulvum MTCC 2004, який раніше не мав важливого значення для біотехнології. Даний продуцент здатний синтезувати 540 г/мл гризеофульвіну, а попередній промисловий продуцент Penicillium urticae - 420 г/мл гризеофульвіну [19, 23].

 

АНАЛІТИЧНИЙ ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

РОЗДІЛ 1. Значення гризеофульвіну у життєдіяльності людини

Ера антибіотикотерапії грибкових інфекцій почалась з відкриття  протидерматофітного препарату  гризеофульвіну і полієнового антибіотика  ністатину в 1951 році. Відтоді з'явились  десятки протигрибкових засобів [7].

Грибковими  захворюваннями страждають, за даними різних авторів, від 25 до 30% дорослого  населення. До групи ризику (тобто  особи, найбільш уразливими і схильні  захворювань) входять члени організованих  колективів (військовослужбовці), відвідувачі лазень і басейнів, власники домашніх тварин, а також люди, які страждають підвищеною пітливістю, плоскостопістю, порушенням кровопостачання нижніх кінцівок, хворі на цукровий діабет та особи, які мають порушення імунного імунітету [12].

Лікування дерматомікозів має проводитися комплексно з  використанням засобів системної  та місцевої терапії. Головним критерієм  при виборі системного антибіотика  є спектр його дії, а якщо етіологія  захворювання невідома або виділено декілька збудників, то призначають препарат широкого спектру дії, що пригнічує активність дерматофітів [10, 12]. Гризеофульвін – ефективний препарат для боротьби проти дерматомікозів широко спектру дії. Застосовують його в практиці вже понад 60 років, але він і досі не втратив своєї актуальності [7].

1.1. Вплив на біохімічні процеси в організмі

Гризеофульвін має фунгістичну дію відносно дерматофітів, трихофітонів, епідермофітів, ахоріонів, мікроспоріум тощо. Не діє на гриби роду Candida, збудників глибоких мікозів (гістоплазмозу, бластомікозу, хромомікозу), а також аспергіли, актиноміцети, різні бактерії і віруси. Механізм дії пов'язаний з пригніченням синтезу білка і утворення клітинної мембрани у чутливих грибів [28].

Гризеофульвін має зв'язок з білками плазми – 80%. Легко адсорбується з травного каналу, тривалий час циркулює в організмі. Особливо високі концентрації у печінці, жировій клітковині, скелетних м'язах. Незначна кількість розподіляється в рідинах і тканинах організму. Проникає через плаценту. Метаболізується в печінці з утворенням основних метаболітів: 6-метилгризеофульвіну та глюкуронідного похідного. Період виведення з орагізму становить 24 год. Виводиться нирками [2, 28].

Передозування препарату призводить до реакції з боку шкіри, контактний дерматит, сухість шкіри, легка печія, свербіж. При всмоктуванні крізь шкіру можливі: головний біль, нудота, блювання, непритомність, явища дезорієнтації, кропив’янка, еозинофілія, лейкопенія.

Препарат проявляє тропність до пошкодженої шкіри, де депонується, зв'язуючись із кератином. При цьому кератин набуває стійкості до збудників вказаних дерматомікозів, а проростаючі волосся і нігті не пошкоджуються інфекцією. Оскільки кератин вмісні структури шкіри постійно злущуються, то в процесі репарації вони замінюються неінфікованими клітинами [28].

1.2. Галузі  застосування та потреба на  ринку гризеофульфіну

Протигрибковий  антибіотик гризеофульвін описаний у 1939 році і впродовж багатьох років  вважався не активним. Тільки з кінця 50 – х років ХХ став використовуватися у клінічній практиці [8].

На сьогоднішній день антибіотик гризеофульвін знайшов широкого використання у медицині та сільськомугогосподарстві.

Гризеофульвін широко використовують у дерматології, препарат діє проти грибкових інфекціях. Антибіотик виявився хорошим засобом проти стригучого лишаю, викликаний грибом Trichophyton rubrum. Він проявляє позитивну дію при лікуванні ряду шкірних захворювань і хворобливий нігтів. Викликає порушення структури мітотичного веретена під час поділу і синтезу клітинної стінки у хітиновмісних грибів, пригнічує поділ грибкових клітин у метафазі і синтез білка через порушення зв'язку з матричною РНК [28].

Гризеофульвін не токсичний препарат, його можна  застосовувати для лікування  дітей. Його випускають у різних лікарських формах.

Також антибіотик гризеофульвін застосовується в онкології. Препарат процеси розходження хромосом під час мітотичного поділу ракових клітин і це призводить до їх руйнуванню. На сьогоднішній день вчені працюють над створенням аналога гризеофульвіну, який буде мати більш виражену протипухлину дію [22, 27].

В сільському господарстві, зоопарках дуже часто використовують цей препарат адже за його допомогою можливо вилікувати тварин. Фабрики, які займаються виробництвом хутра теж дуже активно використовують гризеофульвін, тому що він швидко виявляє свою специфічну дію і зберігається в організмі тривалий час у терапевтичній концентрації. Він ефективний при різному ступені захворювання тварин дерматомікозів а також при зниженому імунітету при проведенні специфічної профілактики і вакцинотерапії. Також можливим є використання у якості кормової добавки [7, 14, 16].

Гризеофульвін використовуються для лікування сільськогосподарських рослин. Ефективний препарат для боротьби з борошнистою росою полуниці, огірків, зі збудником в'янення цитрусових; він проявляє біологічну дію проти збудника кили капусти. Антибіотик, нанесений на наземні частини рослин або внесений в ґрунт, проникає у рослину через кореневу систему, стебло або листя. Однак, гризеофульвін, поширюються по тканинам і органам рослини повільно 30 – 40 хв. Потрапивши в рослину, антибіотики зберігаються в його тканинах порівняно довго – від 5 до 20 діб [7, 14].

Взалежності від  виду виявляються рослини, які можуть накопичувати значні концентрації антибіотика, що надійшов через кореневу систему. Прикладом може слугувати горох, в корінні якого через 30 хв активність антибіотику досягає 30 – 40 од/г, а в листях значно менше - 10 од/г [7].

 

РОЗДІЛ 2. Порівняльна характеристика методів одержання і промислових способів виробництва гризеофульвіну

2.1.Мікробіологічний синтез

З експериментів із уведенням міченої оцтової кислоти було зроблено висновок, що багато які антибіотики синтезуються конденсацією ацетатних та пропіонатних одиниць. До ряду таких антибіотиків входить гризеофульфін, тетрациклін, анзаміцин [8].

Гризеофульвін отримують в промислових умовах при культивуванні Penicillium griseofulvum та P. urticae (P. paiulum) в глибинних умовах в середовищі, що містить кукурудзяний екстракт, лактозу, КН₂Р0₄ і KCl.

Також можливі  такі продуценти гризеофульвіну P. urticae, P. nigricans, P. raislrichi, але вони не знайшли широкого застосування у біотехнології [15].

Схему біосинтезу гризеофульвіну в культурах Penicillium griseofulvum та Penicillium putulum досліджували як із уведенням мічених попередників, так і з виділенням передбачуваних проміжних продуктів. З однієї ацетатної і шести малонатних одиниць утворюється заміщений бензофенон (рис.1).

Рис.1. Загальна схема синтезу гризеофульвіну

Схема перетворення проміжних продуктів, полягає в тому що синтез гризеофульвіну йде від повністю ароматичної структури до частково насиченої. Саме таким шляхом, як правило, здійснюється синтез вторинних метаболітів з ацетату [8].

Важливе значення в процесі  біосинтезу молекули гризеофульвіну має  стадія хлорування (рис.2). Тому що в хімічній будові гризуофульвіна знаходиться атом хлору. Реакції хлорування призводить до утворення грізеофенона С, який в процесі хлорування перетворюється в грізеофенон В; останній в результаті метилювання переходить в грізеофенон А, а потім в гризеофульвін [7].

 

Рис.2. Схема синтезу гризеофульвіну

2.1. Хімічний синтез

Було проведено ряд досліджень щодо можливості хімічно синтезувати гризеофульвіну. Найбільш інтенсивно займались цим британські вчені. Саме завдяки їм у 1952 році було штучно отримано антибіотик гризеофульвін.

В 1959 році Швейцарський вчений А. Броссі повідомив про повну індентифікацію та конфігіруцію молекул з яких утворюється гризеофульвін. Незабаром після того також повідомив англіїський вчений С. Дей, про синтез гризеофульвіну та його антипода.

Починається хімічний синтез гризеофульвіну з флороглюцину, спочатку його перетворюють на його діметиловий ефір з метанольного розчину хлористого водню подальшим хлоруванням з сульфурілхлоридом [24].

Рис. 3 Початкова схема хімічного синтезу гризеофульвіну

І – флороглюцин; ІІ – диметилфлороглюцин; ІІІ – диметилфлороглюцин-4-хлорид; ІV – диметилфлороглюцин-6-хлорид;

Після цього  відбувається ряд перетворень сполуки диметилфлороглюцин-4-хлорид (ІІІ) та її конденсування з сполукою диметилфлороглюцин-6-хлорид (ІV) [24].

Рис.4 Продовження хімічної схеми гризеофульвіну

ІІІ – диметилфлороглюцин-4-хлорид; Х – похідний бензофеноліну; ХІ – бензофенолін; ХІІ – гризеофульвін.

Було досліджено та встановлено оптимальні параметри та умови для хімічного синтезу гризеофульвіну. Докладна схема викладена в додатку 2.

Хімічно синтезивувати  антибіотик гризеофульвін дуже складно. Цей процес займає багато часу та завдає багато клопоту. До того ж необхідно облаштувати лабораторію необідними приладами, щоб забезпечувати всі оптимальні умови для хімічної модифікації сполук.

Реактиви, які  потрібні для хімічного синтезу дуже високовартісні, тому можемо зробити висновок, що хімічна модифікація створення гризеофульвіну є недоцільною та неперспективною в подальшому [24].

2.2. Вплив  основих параметрів та фізико - хімічний вплив одержання гризеофульвіну

В основному, щоб  забезпечити високий вихід антибіотику у промисловості, потрібно забезпечити глибині умови культивуння. Було вивчено мінливість стану Penicillium griseofulvum за рівнем синтезу антибіотика гризеофульвіну при вирощуванні на повноцінних живильних середовищах. Найбільшу продуктивність гриба було встановлено на середовищі з джерелом вуглецю є лактоза, вона утилізується грибом повільніше, ніж, наприклад глюкоза, в результаті чого в період максимального виходу гризеофульвіну лактоза ще міститься в середовищі. [1, 19].

Стимуляція  утворення антибіотика клітинами спостерігається при добавлені до середовища виннокислого амонію [13]. В основному поширення грибів відбувається через утворення екзогенних коній (кодієспори). Формування кодієносців і споруляція залежить від екологічний факторів, наявності в субстратів солей, вуглеводів. Час, необхідний для формування кодієносців, тобто індукції клітин інтервал становить 7 – 14 год, а його довжина збільшується з віком гриба. Пряме світло пригнічує ріст гриба, але чергування освітлення і темноти стимулює і спороутворення [21]. Розвиток культури відіграє важливу роль як у лабораторних і промислових масштабах виробництва будь-якого метаболіту. За оптимальних мікробіологічних показників, а саме, вік організму, стан конідій і склад поживного середовища, можна зменшити лаг-фазу і, можливо, розширити виробництво гризеофульвіну.

Велике значення для P. griseofulvum має аерація. Максимальне його накопичення відбувається при інтенсивності аерації, близькою до одиниці. Зменшення інтенсивності аерації або її надмірне збільшення знижує вихід антибіотика. В залежності від pH культура може змінювати культуральні, морфологічні ознаки, що впливає на фізіологічну активність гриба. Тобто, кількість клітин краще розвивається при pH = 4,5 – 5,5. А синтез антибіотику краще проходить при pH = 6,5 – 7,2. Таким чином, високий вихід гризеофульвіну отримують при наступних умовах розвитку гриба: хороший ріст міцелію, достатнє забезпечення культури поживними речовинами і киснем, оптимальна температура (в період першої фази 28 °С, в період другої фази 24 °С), рівень рН = 6,5 – 7,2 повільне споживання вуглеводів, відповідний попередник [19, 21].

 

ТЕХНОЛОГІЧНА ЧАСТИНА РОБОТИ

РОЗДІЛ 3. Характеристика кінцевого продукту.

Гризеофульвін (грицин) – протигрибковий антибіотик, який виділений із Penicillium griseofulvum. Встановлено будову гризеофульвіну, молекула якого за хімічною природою є гетероциклічним антибіотиком з заміщенним в 7 положені атомом хлору.(рис.5):

Рис.5 Структурна формула гризеофульвіну.

Також існують назви дульцин, фульцин, фульвицин, гризовин, грицин, грифульвін та 7-хлор-2',4,6-триметокси-6'-метил-2'гризен-3,4'-дион [15].

Відомо точну масу однієї молекули, яка дорівнює 352,7663 М. [25]. Температура плавлення гризеофульвіну (С₁₇Н₁₇О₆Сl) складає T_плав =218 – 219 ^оС, субстанція має білий або білий з жовтуватим відтінком колір. Знаходиться у вигляді кристалічного порошку зі слабким специфічним (грибним) запахом. Практично не розчиняється у воді. Малорозчинний в етанолі, метанолі, ацетоні, бензолі, етилацетаті, оцтовій кислоті. Розчинність у диметилформаміді при 25 °C становить 12 - 14 г/100 мл. Стабільний при високій температурі до 160 °C. В ультрафіолетовому опромінені гризеофульвін має максимум поглинання при 236, 252, 291, і 324 нм. [15]

Активність  гризеофульвіну при зовнішньому  застосуванні залежить від дисперсності його кристалів і зумовленою нею  питомої поверхні порошку. Препарат пригнічує синтез білка (зв’язуючись з матричною РНК), порушує формування клітинної стінки (хітин в міцилярних грибах) і мітотичний поділ грибкових клітин [28].

Мінімальна концентрації антибіотика, яка пригнічує ріст міцелярного  гриба, мкг / мл

Microsponim cants	0,22-0,24
Microsporum attdouinii	0,40-0,46
Microsporum attdouinii	0,38-0,42
Trichophyton rubrum	0,14-0,18 [19].

Гризеофульвін - практично не токсичний препарат. Проявляє фунгістатичну дію на збудників трихофітії, мікроспорії, епідермофітії. Застосовується гризеофульвін для ентерального прийому у вигляді таблеток (по 0,125 г), суспензій (0.015 г в 1 мл), місцево – у вигляді 2,5 % лініменту. Призначається по 0,125 г 4 рази на добу в перші 3 тижні щоденно, потім через 1 або 2 дні до зникнення клінічних проявів.

Гризеофульвін посилює дію алкоголю. Під час лікування лініментом гризеофульвін потрібно утримуватись від вживання алкоголю.

При застосуванні препарату рекомендується прийом вітамінних засобів –аскорбінової кислоти  і препаратів, що містять вітаміни групи В. Зберігають при кімнатній температурі 22 ⁰С [2, 28].

 

РОЗДІЛ 4. Обгрунтування вибору технологічної схеми

4.1. Обґрунтування способу проведення біосинтезу

Процес виробництва  біологічно активних речовин в тому числі і біомаси технологічно і технічно може реалізовуватися різними способами. Особливості обраних способів біосинтезу впливатимуть на хід всього виробничого процесу. Тому технологічна схема, що покладена в основу виробництва повинна забезпечувати найкраще поєднання виробничих заходів з точним дотриманням оптимальних умов проведення кожної виробничої стадії.

Культивування продуцентів  біологічно активних речовин можна здійснювати такими способами: поверхневим, глибинним, періодичним та безперервним.

До промислових  способів культивування мікроорганізмів належать періодичне, безперервне культивування та культивування іммобілізованих клітин.

Найбільш поширений  спосіб періодичного культивування. При  даному способі інокулят вносять  у поживне середовище, яке містить  задану кількість всіх необхідних поживних речовин. При цьому ні один з істотних компонентів поживного середовища не надходить у систему у процесі культивування, тобто це закрита система [6].

Періодичне  культивування застосовується як для  поверхневих культур (на поверхні твердого поживного середовища), так і глибинних культур (в рідкому поживному середовищі). Ріст мікроорганізмів припиняється тоді, коли вміст якого-небудь з необхідних компонентів середовища досягає мінімуму або у середовищі накопичуються продукти метаболізму, що інгібують ріст мікроорганізмів.

Існує також  напівбезперервне культивування, коли частина об’єму з біореактора  час від часу вилучається при  додаванні еквівалентного об’єму середовища. Це призводить до регулярного омолодження  культури і до затримки її переходу до фази відмирання. Такий режим культивування в значній мірі уподібнюється безперервному процесу, тому називається також напівбезперервним культивуванням [6].

У безперервних процесах біооб'єкти постійно підтримуються  в експоненційній фазі росту. Забезпечується безперервний приплив свіжого поживного середовища в біореактор і відтік з нього культуральної рідини, що містить клітини та продукти їх життєдіяльності. Фундаментальним принципом безперервних процесів є рівновага між збільшенням біомаси за рахунок поділу клітин і їх зменшенням у результаті розведення свіжим середовищем.

Глибинне культивування  мікроорганізмів має ряд очевидних  переваг перед поверхневим, оскільки дозволяє значно скоротити виробничі  площі, виключити важку непродуктивну  ручну працю, покращити гігієну праці, спрощує механізацію та автоматизацію виробництва, робить можливим перехід на безперервний спосіб культивування. При глибинному способі культивування раціональніше використовуються поживні речовини середовищ, що дають можливість значно скоротити відходи виробництва у вигляді нерозчинних осадів твердого поживного середовища, отримувати препарати з меншим вмістом домішок і більшою питомою активністю. Глибинне культивування проводять у вертикальних герметичних ємностях різного розміру, що називаються ферментаторами [6].

При поверхневому культивуванні механізація процесу  вирощування можлива шляхом створення  безперервно діючих установок. В  цьому випадку мікроорганізми вирощують  на поверхні щільного середовища або  в тонкому шарі рідкого середовища, і кисень надходить до них безпосередньо з повітря.

При поверхневому культивуванні важливо збільшити  площу зіткнення середовища з  повітрям. Для цього середовища наливають  тонким шаром у посуд з широким дном – чашки Петрі, колби Виноградського, матраци. У рідких середовищах аеробні мікроорганізми часто ростуть, утворюючи на поверхні плівку. Факультативні анаероби розвиваються не тільки на поверхні, але і в товщі рідкого середовища, викликаючи більш-менш рівномірне її помутніння. Поверхневе культивування мікроорганізмів застосовується як в лабораторних умовах, так і в промисловості.

Недолік поверхневого способу – необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими  важко механізувати [6].

Отже, враховуючи всі ці дані, культивування P. griseofulvum проводимо глибинним методом. Тому, що цей мікрорганізм росте на рідкому поживному середовищі, потребує постійної аерації, частого технологічного контролю, також за глибинного методу культивування економляться виробничі площі.

4.2. Обґрунтування вибору біологічного агента для антибіотику гризеофульфіну.

У 50-х роках ХХ століття для отримання гризеофульвіну використовувався Р. nigricans, який в процесі розвитку утворює малу концентрацію патуліну (до 26,4 мг/кг ^-1). Патулін - токсична цвіль (мікотоксин). На відміну від більшості інших мікотоксинів патулін розкладається під тривалим кип'ятінням, бродіння фруктових соків або бактерій. Небезпеки для здоров'я патулін в порівнянні з іншими мікотоксинами немає. Але все ж таки, якщо патулін в організмі буде знаходитись в високій концентрації, то він може вкликати нудоту і призвести до гастриту. вихід антибіотику складав понад 300 - 350 мг/л [7, 18].

Потім гризеофульвін отримували культивуванням Penicillium urticae, який синтезував 420 г/мл гризеофульвіну. В глибинних умовах після 150 годин культивування в середовищі (г/л): кукурудзяний екстракт – 1,8; глюкози – 0,9; гідроло - 0,5; лактоза - 0,3; NH₄NO₃ – 0,9; Na₂SO₃ 5H₂O - 0,1; Na₂SO₄ 10H₂O - 0,05; MgSO₄ 7H₂O - 0,025; MnSO₄ 5H₂O - 0,002; ZnSO₄ - 0,02; KH₂PO₄ - 0,2; CaCO₃ - 0,3 та для кращого виходу продукту забезпечували поживне середовище 6 г/л NaCl.

Дане поживне середовище не є доцільним, тому що P .urticae потребує багато кукурудзяного екстракту, високої концентрація амонійних сполук та високої концентрації NaCl. Так як в середовищі міститься, в досить великих концентраціях, легко засвоюваний цукор, глюкоза, то її потрібно вносити дробно. Що до часу синтезу антибіотику, P. urticae потрибує 150 годин, для промислового використання це є не вигідно [4, 8, 19].