Иммуноферментная диагностика вирусных гепатитов

Новосибирский государственный медицинский университет

Факультет усовершенствования врачей 
 
 
 

Цикл  «Лабораторная диагностика. Первичная специализация» 
 
 
 

РЕФЕРАТ  

Иммуноферментная  диагностика вирусных гепатитов. 
 
 
 
 

Выполнила: биолог

лаборатории диагностики СПИД

 г.  Новый Уренгой 

Бельгард  Анна Сергеевна. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Новосибирск 2006

Содержание:

1. Введение.
2. Иммуноферментный метод диагностики.
3. Маркеры вирусного гепатита А.
4. Маркеры вирусного гепатита В
1. HbsAg.
2. HbeAg; anti-HbeAg.
3. HbcAg; anti-HbcAg.
5. Маркеры вирусного гепатита С.
6. Маркеры вирусного гепатита D.

1. Введение.

      Вирусные  гепатиты представляют собой группу нозологически самостоятельных  заболеваний печени. Их разграничение, инициированное эпидемиологами, получило реальную основу после открытия дискретных возбудителей и разработки лабораторных тестов для их обнаружения в инфицированном организме и окружающей среде. Лабораторные тесты существенно дополняют клинико-эпидемиологические данные, обеспечивая раздельную нозологическую диагностику вирусных гепатитов.

      В последние годы проблема этиологии  вирусных гепатитов получило серьезное  развитие, что способствовало разработке методов специфической диагностики  двух основных типов вирусного гепатита. Обнаружение антигенов, а также соответствующих им антител, позволяет проводить специфическую диагностику заболевания в любой его форме и стадии, выявлять наличие смешанной инфекции, разрабатывать и внедрять специфические профилактические мероприятия, выявлять вирусоносительство среди доноров, проводить исследования по экологии вирусов гепатитов.

      В последнее время в РФ отмечен  резкий рост заболеваемости вирусными  гепатитами В и С. О серьезности  проблемы свидетельствуют данные об увеличении частоты неблагоприятных  исходов острых вирусных гепатитов В и С и превращения парентеральных вирусных гепатитов из медицинской проблемы в социальную. 

2. Иммуноферментный  метод диагностики.

      Метод ИФА является одним из наиболее активно  развивающихся направлений химической энзимологии, что обусловлено уникальной специфичностью иммунохимического анализа в сочетании с высокой чувствительностью детекции ферментной метки. Высокая стабильность реагентов, несложность способов регистрации и многие другие достоинства метода ИФА способствовали его широкому внедрению в различные области медицины, биологической промышленности, а также в многочисленные научные исследования.

      Суть  метода ИФА заключается во введении в систему антиген-антитело антигена, меченного ферментом, в результете чего происходит связывание определяемого (немеченого) и меченого антигена с ограниченным количеством антител. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты эффективно осуществляют выработку легковыявляемого вещества, что делает возможным определение ферментной метки в весьма малых концентрациях. По превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие комплекса антиген-антитело.

      Разработка  и внедрение в практику в качестве носителей для сорбционной иммобилизации  антител и антигенов специальных полистирольных планшет, содержащих 96 лунок, позволило значительно увеличить количество проводимых анализов и упростить методическую процедуру выполнения ИФА.

      Отсутствие  стадии разделения свободного и меченого анализируемого соединения дало возможность   сократить время проведения анализа на несколько минут и разработать на этой основе диагностические тест-системы для экспресс определения биологически активных веществ, которые нашли широкие применения в клинической медицине.

      Разновидностями ИФА являются гомогенный и гетерогенный варианты.

      Гомогенный  вариант – ингибирование активности фермента при соединении его с  гаптеном (восстановление активности фермента в результате реакции антиген-антитело, либо наоборот, пот еря активности фермента в результате реакции антиген-антитело). В этом случае удаление свободного антигена из смеси, содержащей антиген в связанном виде, невозможно. Внедрение гомогенного варианта метода ИФА в область практической медицины способствовало созданию высокочувствительных количественных методов для определения широкого круга веществ в биологических жидкостях.

      Гетерогенный  вариант – антиген или антисыворотка  фиксируются на твердой фазе (например, полистирольные планшеты), а не прореагировавшие компоненты реакции удаляются многократным отмыванием. Если существует необходимость количественного определения антигена, то такой анализ может быть проведен при помощи конъюгата антиген-фермент и фиксированных на твердой фазе антител.

      Использование твердых носителей для сорбционной и ковалентной иммобилизации антител позволяет определять как низкомолекулярные, так и высокомолекулярные соединения – антитела, пептидные и стероидные гормоны, вирусные и бактериальные антигены и т.д.

      Метод ИФА имеет ряд преимуществ  по сравнению с  радиоиммунологическим  методом:

• Он является экологически чистым методом;
• Стабильность конъюгатов увеличивает срок годности набора;
• Результаты исследований можно оценивать полуколичественно, т.е. без применения дорогостоящей аппаратуры.

     В будущем метод ИФА, вероятно, сможет полностью вытеснить метод РИА. Это произойдет в том случае, если удастся снизить затраты ручного труда путем автоматизации, освоить приготовление конъюгатов ферментов с молекулами малого веса, а также исключит ковалентное или адсорбционное связывание антигена или антитела с твердой фазой. 

3. Маркеры вирусного  гепатита А.

      Возбудитель вирусного гепатита А (инфекционный гепатит, HAV) относится к семейству пикорнавирусов рода энтеровирусов. Носителем вирусной информации  HAV является однонитчатая РНК. Вирус представляет собой частицу, имеющую форму икосаэдра, размером 27-32 нм. Для гепатита А известен один вирусоспецифический антиген (HAV-Ag), гомогенный в антигеном отношении.

      Возбудитель гепатита А обладает значительной устойчивостью  во внешней среде. При температуре +4⁰С он может сохранять свою вирулентность в течение нескольких лет. Вирус устойчив и остается активным при воздействии на него эфира и кислот. При нагревании до температуры +60⁰С в течении 10 минут происходит лишь частичная инактивация вируса. Погибает он при кипячении в течение 5 минут, а также воздействии хлорамина(30 мин.) и ультрафиолетового облучения в течение 1 минуты. Вирус гепатита Распространен во всех странах мира. На долю детей  (в общей структуре заболеваемости) приходится более 70% случаев. Заражение гепатитом А происходит фекально-оральным путем. Передача вируса осуществляется посредством прямого и непрямого контакта, а также с инфицированными пищевыми продуктами и водой.

      Для гепатита А характерна сезонность с  наибольшей заболеваемостью в осеннее-зимний период. Восприимчивость к HAV абсолютная. После перенесенного гепатита А формируется стойкий пожизненный иммунитет.

      В сравнении с другими поражениями  печени гепатит А – относительно доброкачественная болезнь: длительность клинических проявлений при этом заболевании редко превышает 2 недели, состояние печени, как правило, нормализуется в течение 1 месяца, заболевание не оставляет хронических последствий.

      Набор клинических симптомов невелик, но сложность заключается в том, что другие вирусные гепатиты имеют в остром периоде сходную симптоматику. Первые симптому появляются через 2-4 недели после заражения в виде недомогания, подъема температуры, желтухи.

      Диагноз гепатита А подтверждается, если определяется присутствие в сыворотке больного специфических антител класса IgM (anti-HAV IgM), поскольку такие антитела сохраняются у больного не более 2 мес. И их наличие однозначно свидетельствует о недавно перенесенном или текущем вирусном гепатите А.

      Вирусоспецифический антиген обнаруживается в преджелтушном периоде и в первые дни желтухи. Начиная с первого дня болезни в сыворотке крови у всех больных выявляются anti-HAV IgM; а в периоде ранней реконвалесценции anti-HAV IgM вместе с anti-HAV IgG. В период поздней реконвалесценции обнаруживается только anti-HAV IgG, являющийся показателем иммунитета к вирусу гепатита А. 

4. Маркеры вирусного  гепатита В.

      Вирус гепатита В принадлежит к семейству  гепатотропных ДНК-содержащих вирусов (Hepadnaviridae).

      Вирус гепатита В – один из мельчайших оболочечных вирусов человека. Его вирион (частица Дейна) имеет сферическую форму диаметром 40-45 нм. Под электронным микроскопом в вирионах видны сердцевина – нуклеокапсид вируса и наружная липопротеиновая оболочка – суперкапсид.

      Антигенные  детерминанты суперкапсида принято обозначать как  HbsAg, Антигенные детерминанты сердцевины частицы Дейна – HbcAg (кор-антиген). Кроме того, в крови больных гепатитов В найден еще один антиген – HbeAg, который образуется в результате протеолиза кор-антигена, встроенного в клеточные мембраны.

      Заражение гепатитов В происходит парентеральным путем: при переливании инфицированной крови или ее препаратов, при использовании  инфицированного медицинского инструментария, при выполнении татуировок, лечении  зубов и других манипуляций, при которых нарушается целостность кожных покровов и слизистых оболочек.

      Основными естественными путями передачи вируса гепатита В является половой и  вертикальный (от матери к ребенку, обычно при родах или грудном  вскармливании). Риск вертикальной передачи гепатита В возрастает, если у матери в крови обнаруживается HbsAg – маркер активной репликации гепатита В. Заражение часто происходит в семейных очагах при тесном контакте с хроническим носителем HBV. Инфицирование при этом происходит парентерально через микротравмы в случае попадания вируссодержащей биологической жидкости на поврежденные покровы и слизистые. 

4.1 HbsAg.

      Поверхностный антиген вируса гепатита В – HbsAg (австралийский антиген), сохраняет свою стабильность при воздействии эфира, хлороформа, нечувствителен к кислым средам, имеет высокую термостабильность.

      В пораженном гепатоците специфический  вирусный белок кодирует продукцию  избыточного количества HbsAg, поступающего в кровь. Это первый и наиболее доступный для выявления специфический маркер вирусного гепатита В. Само по себе обнаружение HbsAg в крови может указывать лишь на состоявшееся инфицирование.

      Установлено, что у лиц, инфицированных ВГВ, HbsAg обнаруживается во всех биологических средах организма: в крови, сперме, моче, слюне, слезах,  желчи, грудном молоке, вагинальном секрете, ликворе, синовиальной жидкости. Однако, реальную эпидемиологическую опасность представляют лишь кровь, сперма и вагинальный секрет, в меньшей степени слюна.

      Обнаружение HbsAg в сыворотке крови является признаком инфицирования ВГВ и в комплексе с иными клинико-лабораторными исследованиями подтверждает диагноз острого или хронического гепатита В. 

4.2 HbeAg; anti-HbeAg.

      Антиген Hbe (HbeAg, англ. envelope – оболочка) представляет собой один из белков, содержащихся в ядре Дейна, и обнаруживается в кровеносном русле в свободной или связанной форме. Установлено, что при попадании сыворотки крови, содержащей HbeAg, в кровь здорового человека, опасность заражения намного выше, чем после наступления сероконверсии с исчезновением HbeAg и появлением anti-HbeAg. При этом титр HbeAg может остаться без изменения. Предполагается, что длительное сохранение в сыворотке крови больных HbeAg может свидетельствовать о переходе процесса в хроническую форму. HbeAg имеет непосредственное отношение к частицам Дейна, являясь составной частью HbcAg.

      Присутствие HbеAg коррелирует с активностью ДНК-полимеразы и обнаружением частиц Дейна. Этот антиген выявляется в ранние сроки болезни, сменяясь затем anti-HbeAg. Антигены HbеAg и anti-HbeAg являются полезными маркерами, свидетельствующие о репликации вируса гепатита В в гепатоцитах и высокой инфекционности пробы. 

4.3 HbсAg; anti-HbсAg.

      Антиген Hbс выявляется как в частицах Дейна, так и в ядрах пораженных гепатоцитов. В сыворотке и в плазме крови HbсAg в свободном виде не определяется. Для обнаружения HbсAg и соответствующих ему антител применяют антитела, меченые пероксидазой. В крови больного гепатитом В очень быстро появляются anti-Hbс, выявление которых имеет важное диагностическое значение. Аnti-Hbс класса IgM обнаруживаются в высоких титрах уже в начале острой фазы заболевания. Их выявление является убедительным критерием диагностики гепатита В, особенно при отрицательных результатах HbsAg. Данные антитела присутствуют в крови больного в течение нескольких месяцев, а затем исчезают, что рассматривают как признак очищения организма от вируса гепатита В. В период реконвалесценции выявляются anti-Hbс класса IgG совместно с anti-Hbs и anti-Hbе. Однако, довольно часто наличие их является единственным показателем инфекции в прошлом.

      В большинстве случаев в период острой стадии гепатита В содержание anti-Hbс IgM  значительно повышено. В случае незначительного повышения уровня  anti-Hbс IgM  , хронический гепатит может быть подтвержден при получении положительных результатов в тестах на выявление HbsAg и HbеAg.

      Первым  признаком возникновения иммунологической реакции на острую инфекцию вирусом  гепатита В, вскоре после появления  в сыворотке крови поверхностных  антигенов (HbsAg и HbеAg), но еще до появления антител к ним (anti-Hbs и anti-Hbе), является выработка антител к HbсAg. Данные  антитела можно обнаружить после исчезновения HbsAg и HbеAg, часто пожизненно. При отсутствии HbsAg или anti-Hbs антител присутствие anti-Hbс антител может служить единственным серологическим маркеров перенесенного вирусного гепатита В как потенциальной инфицированности крови.

     Около 10% случаев заболевания ВГВ выявляются только при исследовании на anti-Hbс антитела. Кроме того, определение anti-Hbс антител можно использовать при дифференциальной диагностике гепатитов А и В, и в сочетании с определением повышенной активности аланинаминотрансферазы в качестве замещающего маркера на гепатит С. 

5. Маркеры вирусного  гепатита С.

      Гепатит С вызывается вирусом (HCV), не имеющим серологических связей с вирусными гепатитами А и В. Вирус определяется как в сыворотке крови, так и в экстрактах печени человека и имеет размеры от 22 до 60 нм. Удельный вес гепатита С по данным разных авторов составляет 10-30% общей заболеваемости вирусными гепатитами с периодическим обострением процесса.

      В настоящее время считается, что  диагноз гепатита С может быть правомочным при отсутствии в  крови больного HbsAg, anti-Hbs IgM, anti-Hbс IgM, anti-HАV IgM, нарастания титра anti-Hbs IgG, anti-HАV IgG (если эти антитела имелись до заболевания). Клинически гепатит С протекает более легко, чем гепатит В. Инкубационный период составляет 30-40 суток. Течение заболевания в основном легкое (за исключением беременных) и заканчивается полным выздоровлением. Однако, показано, что почти у 50% пациентов болезнь принимает хроническое течение.

      В отличие от гепатита В, при исследовании гепатита С методом ИФА обнаруживаются только антитела IgM и IgG, так как антигены в крови находятся на грани чувствительности метода. Они могут быть определены в биоптатах печени иммуногистохимическим методом.

      Положительный результат анализа ИФА подтверждает  наличие инфицированности гепатитом  С. Образцы сыворотки, взятой на исследование, допускается хранить не более 5 суток при температуре +4⁰С. Не допускается многократное замораживание и размораживание сыворотки. В образце не должно выявляться выраженной гиперлипидемии и гемолиза.

      Острая  фаза гепатита С клинически отличима от других вирусных гепатитов. Желтуха  является хорошим диагностическим признаком, а длительная циркуляция anti-HСV IgM (более 2 мес.) – плохим, свидетельствующей о возможной хронизации процесса.

      Латентная форма соответствует хроническому течению инфекции с развитием  клинически манифестного хронического гепатита В. В латентной фазе anti-HСV IgM не обнаруживается, либо обнаруживается в низких концентрациях в связи с волнообразностью наработки антител.

        Фаза реактивации соответствует  хронической стадии гепатита  С с последующим развитием  в цирроз печени и гепатокарциному. Основным критерием оценки хронического гепатита С является динамический контроль за anti-HСV IgM, так как в фазу обострений концентрация этих антител всегда увеличивается.

      Отличительной особенностью гепатита С является высокая  летальность, особенно среди беременных женщин, преимущественно в III триместре, и достигает 20-40% и более. Поэтому выявление инфицирования вирусом гепатита С приобретает важное диагностическое значение. 

6. Маркеры вирусного  гепатита D.

      Вирус гепатита D (дельта-гепатит, HDV) по своим свойствам наиболее близок к вироидам и сателлитным вирусам растений. Он характеризуется сферической формой частиц и размером 35-37 нм в диаметре. Вирус гепатита D является дефектным вирусом, что проявляется в его зависимости от вируса помощника (HВV). Последний представляет HDV свой суперкапсид вместе с его главным компонентом – HbsAg. Исследования показали, что антиген гепатита D (HDAg) представляет собой белок, стабильный к нагреванию, кислотам, нуклеазам, гликозидам.

      Заражение гепатитом D происходит только при непосредственном попадании вируса в кровь, гораздо реже имеет место вертикальная передача от матери к ребенку. Продолжительность инкубационного периода колеблется от 3 до 7 недель.

      Так же как и при других гепатитах, большое значение для постановки диагноза и контроля за течением заболевания имеют серологические маркеры инфицирования. К ним относят: HDAg, anti-HDV IgM, anti-HDV IgG и РНК- HDV.

      Хроническая HDV-инфекция характеризуется высоким титром HDAg (более 1:5000). Активная репликация HDAg коррелирует с наличием HDAg в печени и anti-HDV IgM в сыворотке.

      Выявление дельта-инфекции является плохим прогностическим  признаком, свидетельствующим о  возможном быстром исходе заболевания  в цирроз печени.

      При суперинфекции в остром периоде заболевания HDAg выявляется в сыворотке кратковременно, а в некоторых случаях вовсе не обнаруживается, хотя результаты исследования гепатоцитов свидетельствуют о длительном его синтезе. В остром периоде заболевания идентифицируют также anti-HDV IgM. Аnti-HDV IgG могут длительно обнаруживаться в периоде реконвалесценции и на протяжении нескольких лет в процессе хронического гепатита.

      Чрезвычайно важное диагностическое значение приобретает  тот факт, что у больных с  хроническим гепатитом D чаще регистрируются более тяжелые поражения печени. 
 
 
 
 

Список  литературы:

1. Таранов А.Г. Диагностические тест-системы. Радиоиммунный и иммуноферментный методы диагностики. М.: Мокеев, 2002.
2. Таранов А.Г. Лабораторная диагностика. Радиоиммунный и иммуноферментный методы анализа. Новосибирск: Символ, 1995.
3. Гользанд И.В., Благословенский Г.С. Хронический гепатит. М.: Медицина, 1978.
4. Фарбер Н.А., Мартынов К.А. Вирусные гепатиты. М.: Медицина, 1990.