Мікотоксини в харчових продуктах

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат на тему:

«Мікотоксини в харчових продуктах»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Київ 2012 
План

1. Вступ
2. Основні групи мікотоксинів:

а)афлатотоксини;

б)трихоцетени;

в)зеараленон  і зеараленол;

г)охратоксини;

д)патулін.

3. Дії, спрямовані на зменшення шкідливого впливу мікотоксинів на здоров’я
4. Нормативно-правова база по визначенню мікотоксинів в харчових продуктах харчування.
5. Кількісний аналіз мікотоксинів:

а)хроматографічні методи;

б)імуноферментні методи.

6.Якісний аналіз мікотоксинів.

7.Особливості аналізу  мікотоксинів в Україні.

8.Висновок.

9.Список використаної  літератури

 

 

Назва мікотоксинів походить  від грецьких коренів гриб - «mykes» і отрута - «toxikon». Мікотоксини є продуктами життєдіяльності (вторинними метаболітами) мікроскопічних грибів Aspergillus, Fusarium, Penicillum та деяких інших. Відомо кілька сот мікотоксинів,що продукуються більш ніж 250 видами грибів.

Токсична дія мікотоксинів обумовлюється їх взаємодією з нуклеофільними ділянками молекул ДНК, РНК і білків, що призводить до порушення і придушення процесів білкового біосинтезу. Мікотоксини володіють також і вираженими мутагенними (включаючи гепатоканцерогенні) властивостями.

Мікотоксини порушують функцію кровотворних органів, негативно впливають на роботу центральної нервової системи, викликають лейкопенію, дерматотоксикози, геморагічний синдром, здатні викликати кілька видів мікотоксикозів у людини і тварин, імунодепресивну активність. 
 До найбільш небезпечних видів мікотоксинів, за їх впливом на організм, можуть належать:

• Канцерогенні (утворення і розвиток злоякісних пухлин)
• Мутагенні (кількісні та якісні зміни в спадковому апараті клітини)
• Тератогенні (функціональні, біохімічні, і структурні зміни в організмі матері і зародку, що викликаються дією зовнішніх, в даному випадку - біохімічних факторів).

  Більшість мікотоксинів - це стійкі до термічного впливу, добре розчинні в розчинниках органічного типу кристалічні речовини. За невеликим винятком, мікотоксини стійкі до впливу кислотного середовища, але можуть руйнуватися з утворенням малотоксичних сполук під впливом концентрованих лугів. 
 За хімічною будовою виділяють наступні основні типи мікотоксинів:    Канцерогенні (утворення і розвиток злоякісних пухлин)

• Афлатотоксини
• Трихоцетени
• Зеараленон  і зеараленол
• Охратоксини
• Патулін 
  

 

2.Афлотоксини

У цю групу входять більш 15 мікотоксинів, які продукуються грибами  Aspergillus flavus і Aspergillus раrasiticus. Основні забруднювачі (головним чином токсин В) харчових продуктів. Високою токсичністю володіють афлатоксини В1, В2, G1 та G2 (для афлатоксину B1 ЛД50 7,8 мг / кг, макаки, ​​перорально). Афлатоксини - сильні мутагени (в т.ч. гепатоканцерогени), мають також тератогенним та імунодепресивну дію. Токсична дія зумовлена ​​їх взаємодією з нуклеофільними ділянками ДНК, РНК і білків. 
 У ряді країн Африки та Азії, де спостерігаються гострі афлатоксікози у людей, виявлена ​​пряма кореляція між частотою захворювання населення на рак печінки і вмістом афлатоксинов в харчових продуктах. Хімічна детоксикація кормів аміаком при підвищеному тиску і температурі (США, Франція) або пероксидом водню (Індія) дозволяє знизити вміст афлатоксинов до безпечного рівня. При цьому, однак, втрачається частина пітатательной цінності корму. Перспективна біологічна детоксикація афлатоксинов та інших мікотоксинів деякими видами мікроорганізмів. При вживанні тваринами кормів, забруднених афлатоксином В1, з молоком виділяється високотоксичний афлатоксин M1.

Рис.1. Структурны формули основних представників афлотоксинів

Локалізація афлотоксинів в харчових продуктах - горіхи, кукурудза, молоко (до 3% з корму) та молочні продукти.

Напрямки  дії афлотоксинів на організм людини та тварин:

• канцерогенна
• гепатотоксична
• мутагенна
• тератогенна

При цьому основним органом-мішенню  виступає печінка.

Механізм токсичної дії  афлотоксинів обумовлений їх взаємодією з нуклеофільними ділянками ДНК, РНК і білків.

Табл.1. Гранично допустимий вміст афлотоксинуВ1

Харчовий продукт	ГДК, мкг/кг
зерно, горіхи, кава, чай, какао	0,005
пшениця,овес,ячмінь,просо,рис,кукурудза	0,005
борошно	0,005
макаронні вироби	0,00015

 

Нормативи ГДК по афлотоксинам (табл.1) свідчать про їх високу гостру токсичність. Менше значення ГДК для макаронних виробів пов’язано з частотую їх вживання людиною.

Трихотецени

  Продукуються грибами Fusarium sporotrichiella, Fusarium solani, Fusarium graminearum і деякими іншими. Включають більше 80 мікотоксинів, які поділяють на 4 типи: А, В, С і D. Представники групи А – токсин, Т-2 і діацетоксі-скірпенол, групи В - дезоксиниваленола і ніваленол, групи С - рорідін А, групи D – кротоцін ( див. табл. 3). ЛД₅₀ для цих мікотоксинів (миші, перорально) варіює від 6,7 мг/кг (токсин Т-2) до 46 мг/кг (дезоксиниваленола). Біосинтез трихотеценів здійснюється через лактон мевалонової кислоти і фарнезил-пірофосфат. 
 Трихотецени проявляють тератогенні, цитотоксичні, імунодепресивні, дерматотоксичні властивості, діють на кровотворні органи, центральну нервову систему, викликають лейкопенію, геморагічний синдром, відповідальні за ряд харчових мікотоксикозів людини і тварин. Токсичні властивості обумовлені їх участю в придушенні біосинтезу білка. З усіх тріхотеценов природними забруднювачами харчових продуктів є тільки 4.

Печінка - основний орган, в якому метаболізуються тріхотецени. Інші тканини, наприклад, тканини кишечника, здатні піддавати мікотоксини біотрансформації.

Більша частина радіоактивно міченого Т-2 токсину зосереджується в жовчі і шлунково-кишковому тракті незалежно від шляху введення в організм: внутрішньовенно, внутрішньом'язово, per os або через шкірні покриви. До 95% міченого Т-2 токсину, введеного внутрішньовенно, виводиться з організму з сечею і фекаліями у співвідношенні 3:1

Нормативи ГДК мікотоксинів трихоцетинового ряду наведено в табл.2

Табл.2. Гранично допустимий вміст трихоцетину Т-2

Харчовий продукт	ГДК, мкг/кг
пшениця,овес,ячмінь,просо,рис,кукурудза	0,1
пшенична крупа	0,7
борошно	0,1
макаронні вироби	0,05

 

 

Табл.3. Структура трихоцетинових мікотоксинів різних типів

Охратоксини

У цю групу входять Охратоксини А, В і С (див. рис.2). Продукуються грибами Aspergillus ochraceus і Penicillium viridicatum. Найбільш токсичний охратоксин А (ЛД50 3,4 мг / кг, одноденні курчата, перорально). Інші мікотоксини цієї групи на порядок менш токсичні. Охратоксин А (ним найбільш часто забруднюються харчові продукти) в чистому вигляді нестабільний, чутливий до дії світла і кисню, стійкий в розчинах. Ці мікотоксини володіють нефротоксичність, тератогенна та імунодепресивну дію. Інгібують синтез білка, порушують обмін глікогену. Охратоксини відповідальні за виникнення нефропатії у свиней.

Рис.2.Структурні формули  охратоксинів

Локалізація охратоксинів в харчових продуктах – зерно, кава, сушені фрукти і червоне вино. Особливо часто заражає яблука. Може бути поражено до 50% врожаю.

Охратоксин А (найбільш розповсюджений) в чистому вигляді нестабільний, чутливий до дії світла і кисню, стійкий в розчинах. Може накопичуватися в м'ясі тварин.

Особливості дії на організм: нефротоксичний, тератогенний та імунодепресивний вплив . Інгібують синтез білку, порушують обмін глікогену.

Нормативи ГДК по охратоксинам наведені в таблиці 4.

Табл.4. Гранично допустимий вміст Охратоксину А

Харчовий продукт	ГДК, мкг/кг
пшениця,овес,ячмінь,просо,рис,кукурудза	0,005
пшенична крупа,молоко	0,005
борошно	0,005
Продукти дитячого харчування	0,0005

З табл. 4 що охратоксини є одними з найбільш небезпечних груп мікотоксинів.

Патулін

  Мікотоксин патулін (рис.3) найчастіше утворюється в некондиційних фруктах і ягодах, міститьсяв соках, вареннях. Рис.3.Структурна формула Патуліну

Вперше виділений в 1943 році як антибіотик. Продукується грибом Penicillium expansum; ЛД₅₀ = 17-36 мг / кг (миші, перорально).

Дія на організм: має високі мутагенні властивості. Інгібує синтез білку, ДНК, РНК, ферменти, що містять в активному центрі групи SH.

Він дуже небезпечний для маленьких дітей і вагітних жінок, оскільки має мутагенну і тератогенну дію (служить причиною каліцтв), викликає омертвіння кліток. ГДК по мікотоксіну патуліну в яблучному соку відповідно з нормою ВООЗ не повинен перевищувати 0,03 мг / кг.Насправді ж, за дослідженнями, проведеними в Новосибірську в 2000 р., 80% соків містили його в концентрації до 2 (!) мг / кг.

Зеараленон  і зеараленол

Зеараленон (рис.4) продукується головним чином F. graminearum, F. culmorum, F. cerealis, F. Equiseti і F. semitectum і часто зустрічається в компанії з зеараленоламі (α-і β-ізомерами зеараленола). Зеараленон (рис.4) є одним з найбільш поширених мікотоксинів Fusarium і дуже часто накопичується у високій концентрації.

Для зеараленону ЛД₅₀ = 10000 мг / кг (щури, перорально). ГДК для цих сполук мають також досить високі для мікотоксинів значення (табл..5). Тобто гострої токсичності ,порівняно з іншими мікотоксинами, ці сполуки не проявляють, натомість чинять серйозний хронічно токсичний вплив.

Дія на організм: взаємодія з естрадіолзвязуючими рецепторами в клітинах-мішенях. Мають естрогенні та тератогенних властивостями, а також антибактеріальну дію відносно грампозитивних бактерій.

Рис.4.Структурні формули  Зеараленону (1)  і Зеараленолу (2)

Табл.5. Гранично допустимий вміст Зеараленону

Харчовий продукт	ГДК, мг/кг
пшениця,овес,ячмінь,просо,рис,кукурудза	1,0
толокно, пластівці (пшеничні,кукурудзіні,ячмінні)	0,2
борошно	0,005
Макаронні вироби	0,0005

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.Таким чином, мікотоксини становлять серйозну небезпеку для здров'я людини. Можна сформулювати наступні положення, що дозволять зменшити небезпеку отруєння цими сполуками:

• не використовувати для приготування їжі зіпсовані продукти: крупи, борошно, хліб, макаронні вироби, овочі і фрукти, горіхи;
• не  використовувати чахле, забруднена зерно або крупу;
• просушувати або прожарювати куплене зерно, борошно і крупу;
• перебирати крупи перед їх використанням і не використовувати зерно, борошно або крупу, якщо вони запліснявіли або мають запах цвілі;
• не можна використовувати горіхи, особливо очищені, якщо термін їх зберігання закінчився, а вони мають запах цвілі або запліснявіли;
• слід уникати вживання будь-яких запліснявілих продуктів, у тому числі запліснявілого сиру і ковбаси, адже термообробка майже не руйнує мікотоксини; 
  категорично не можна використовувати запліснілий хліб: обрізання ділянок з цвіллю нічого не дає - батон забруднений повністю;
• не слід їсти або використовувати для приготування їжі (варення, компоту) частково зіпсовані фрукти, особливо яблука: здорова на вигляд частина зіпсованого яблука може бути сильно зараженої мікотоксіном;
• домашні тварини, особливо кішки і собаки, дуже чутливі до мікотоксинів, що містяться в кормах. До їжі для тварин слід ставитися так само, як і до їжі для людей, наприклад не слід годувати птицю пліснявим хлібом; 
  

 

 

 

 

 

 

 

 

4.Нормативно-правова база по визначенню мікотоксинів в харчових продуктах харчування:

• ДСТУ EN 12955-2001 (Продукты пищевые. Определение афлатоксина-В1 и суммы афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 в зерновых культурах, фруктах с твердой кожурой и производных от них продуктах. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью постколоночной дериватизации и очистки на иммунной колонке (EN 12955:1999, IDT)

• ДСТУ EN ISO 15141-1-2001 (Продукты пищевые. Определение содержания охратоксина А в зерне и зерновых продуктах. Часть 1. Метод жидкостной хроматографии высокого разрешения и очисткой силикагелем (EN ISO 15141-1:1998, IDT)

• ДСТУ EN ISO 15141-2-2001 (ДСТУ EN ISO 15141-2-2001  Продукты пищевые. Определение содержания охратоксина А в зерне и зерновых продуктах. Часть 2. Метод жидкостной хроматографии высокого разрешения с очисткой бикарбонатом (EN ISO 15141-2:1998, IDT)

• МУ 4082-86 (Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии)

• ГОСТ Р 52471-2005 (Корма. Иммуноферментный метод определения микотоксинов)

• ГОСТ Р 53162-2008 (Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии)

• ГОСТ 30711-2001(Продукты пищевые. Методы выявления и определения содержания афлатоксинов В1 и М1)

• ГОСТ Р 53162-2008 (Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии)

• МУ 5177-90 (указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах)

Таким чином, основними методами визначення мікотоксинів в харчових продуктах є імуно-ферментний та метод ВЕРХ.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.Кількісний аналіз мікотоксинів

Метод високоефективної  рідинної  хроматографії.

Молочні продукти

Пробопідготовка складається з етапів відбору проби; осадження білка шляхом первинної екстракції мікотоксинів розчином NaCl і лимонної кислоти при нагріванні і подальшої екстракції хлороформом в конічній колбі; центрифугування; перенесення вмісту пробірок (без білкового осаду) в ділильну воронку, додаткової промивки білкових осадів хлороформом і перенесення хлороформних шарів в ділильну воронку, упарювання відокремленого хлороформного шару на роторному випарнику, додавання точних об’ємів дистильованої води і гексану, поділу водного та гексанового шарів в ділильній воронці, відділення водного шару, повторного додавання до водного шару гексану, поділу шарів у ділильної воронці; наступного очищення та концентрування водного шару (знежиреного водного екстракту) з добавкою 5% ацетонітрилу методом твердофазної екстракції, елюювання , віддування елюента до заданого обсягу при температурі не вище 50 ° С.

Хлібобулочні  вироби, мука,зерно.

Тверді вироби (макарони, сушки, сухарі) попередньо подрібнюють у блендері до стану гомогенної маси.

Кондитерські вироби (торти, тістечка), хліб і хлібобулочні вироби (булки) для забезпечення однорідності проби та видалення надлишкової вологи змішують з натрієм сірчанокислим в співвідношенні 1:3 (за масою) і гомогенізують в блендері до стану гомогенної маси.

Проби муки (різних сортів) і пряностей у вигляді порошку (перець, кориця) не вимагають попереднього подрібнення.

Пробу продукту (подрібнену, гомогенізований) екстрагують ацетонітрилом, екстракт фільтрують через фільтруючу насадку PTFE (0.45 мкм, d = 30 мм) за допомогою одноразового шприца, до фільтрату доливають заданий обсяг дистильованої води, отриману емульсію піддають очищенню за допомогою твердофазної екстракції на картриджах Strata C18 -E, зібраний з картриджа елюатів віддувають до заданого обсягу. До сконцентрованого після віддування елюату додають розчину йоду і залишають на 20 хв при кімнатній температурі.

 

Горіхи

Подрібнену (гомогенізовану) пробу продукту екстрагують хлористим метиленом, використовуючи УЗ-ванну, в колбі з поліетіеновой пробкою. Колбу з екстрактом поміщають в холодильній камеру (температура +5 ° С) для осадження твердих частинок. Після осадження твердого шару верхній шар декантирують в пробірки і центрифугують. Верхній шар з центріфужнихсклянки пробірок фільтрують в мірний скляний циліндр з допомогою пластикового одноразового шприца через ущільнену в шприці пробку з фільтрувального паперу. Фільтрат віддувають до заданого обсягу, доливають заданий обсяг гексану, вміст циліндра перемішують за допомогою УЗ-ванни. Отриманий розчин піддають очищенню за допомогою твердофазної екстракції. Зібраний елюат залишають при кімнатній температурі на час не менше ніж 20 хв.

Загальні  підходи до пробо підготовки при  визначенні мікотоксинів в харчових продуктах:

• екстракція мікотоксину  з проби органічним розчинником;
• очищення та концентрування екстракту;
• підготовка проби для введення в хроматограф.

Далі аналіз в більшості  випадків проводять з використанням  вфлуориметричного детектора методом зовнішнього стандарту.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Імуно-ферментні методи в аналізі мікотоксинів

Імуноферментний метод оснований на вимірюванні вмісту мікотоксинів в пробах за допомогою непрямого твердо фазного конкурентного ІФА робочих розчинів екстрактів (рис.5)

Непрямий ІФА заснований на здатності мікотоксинів взаємодіяти зі специфічними антитілами в умовах конкуренції з білковим кон’югатом мікотоксину,нанесеним на поверхню комірок планшету, - твердо фазним агентом.

Аналітичний сигнал (значення оптичної густини), що відображає ступінь  взаємодії між антитілом і  антигеном, обернено пропорційний концентрації мікотоксину в розчині

 

 

 

Рис.5. Основні етапи імуноферментного визначення мікотоксинів

 

 

 

6.Якіний аналіз мікотоксинів

Для якісної ідентифікації  мікотоксинів може бути використана тонкошарова хроматтограія а також ІФА.

При якісній ідентифікації  методом ТШХ пластинку для ТШХ ("Силуфол") розмічають тонкими олівцевими лініями. На горизонтальну лінію,  наносять за допомогою мікрошприця робочі розчини мікотоксинів. На відстані 1 см від плям наносять розчини стандартів розчину стандарту. Пластинку поміщають в камеру для ТШХ з сумішшю ефір-метанол-вода (94:4,5:1,5). Пластинку витягають з камери, сушать на повітрі 5 хв. І  розглядають в довгохвильовому УФ-світлі. Виявлення на пластинці плям, відповідних по хроматографічної рухливості і кольором флуоресценції плямам стандартів, свідчить про можливу наявність мікотоксинів в пробі.

Якісний аналіз іммуно-ферментним методом проводиться аналогічно кількісному визначенню. На останній стадії проводиться візуальне порівняння стандартних і досліджуваних розчинів.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.Особливості аналізу мікотоксинів в Україні:

• діючі стандарти регламентують вміст не всіх мікотоксинів (наприклад, не регламентується і не визначається вміст фумонізін, фузапроліферіна та деяких інших токсинів).
• значна маса сільгосппродукції реалізується через ринки або в формі оплати праці (наприклад, зерном часто оплачується оренда земельних паїв). Ця продукція не проходить необхідних перевірок.
• в домашньому господарстві плісняві продукти зазвичай не знищуються видаляється їх частина, що має чіткі ознаки цвілі, а зовні нормальні використовуються для приготування їжі, хоча вони можуть містити і, як правило, містять мікотоксини.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Висновок: мікотоксини – розповсюджена група токсикантів не техногенного походження, що утворюються внаслідок діяльность мікроорганізмів. Мають виражену гостру та хронічну токсичність. Небезпеку становить є також недостатня інформованість споживачів про шкоду мікотоксинів і особливості ураження ними харчових продуктів.

Основними методами кількісного  визначення мікотоксинів є

Метод ВЕРХ та імуноферментні методи. Для якісної ідентифікації мікотоксинів  

Застосовують методи тонкошарової хроматографії а також імуноферментні методи

Діюча нормативно-правова  база по визначенню мікотоксинів в Україні не є досконалою і потребує вдосконалення.

 

 

 

 

 

 

 

 

Список використаної літератури

1. Артюх В. П., Гойстер О. С., Хмельницький Г. О., Стародуб М. Ф. Трихотециновые микотоксины: природа, биотрансформация, биологические эффекты // Современные проблемы токсикологии. —2002.— № 4.
2. Bennett W., Klich M. Mycotoxins // Clinical Microbiology Review.— 2003.— V. 16, № 3.— Р. 497-516
3. Smith, J. E.; Moss, M. O// Formation, analysis and significance. -2003.-148 р
4. Hussein S. Hussein , Jeffrey M. Brasel// Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and animals.-2001.- Toxicology 167. – Р. 101–134.
5. Krogh, P.  Mycotoxins in food. -1987.-  263pp.
6. J. Chem. Soc., Chem. Commun// Structure elucidation of the fumonisins, mycotoxins from Fusarium moniliforme.- J. Chem. Soc., Chem. Commun.,-1988-Р. 743-745

7. Eric W. Sydenham, Pieter G. Thiel, Walter F. O. Marasas, Gordon S. Shephard, Dirk J. Van Schalkwyk, Klaus R. Koch// Natural occurrence of some Fusarium mycotoxins in corn from low and high esophageal cancer prevalence areas of the Transkei, Southern Africa.- 1990- J. Agric. Food Chem., , 38 (10), Р. 1900–1903

8. http://www.mycotoxins.info
9. http://www.prochrom.ru
10. http://ru.wikipedia.org