Общие принципы работы электронного микроскопа

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО  ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УЛЬЯНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ИМЕНИ П.А. СТОЛЫПИНА

Факультет ветеринарной медицины

Кафедра микробиологии, вирусологии и ветеринарно-санитарной экспертизы

Реферат

по учебной практике на тему:

«Общие принципы работы электронного микроскопа»

Выполнил:

студент 4-го курса ФВМ  специальности «Микробиология»

Сахабутдинов  М.М.

Проверила:

к.б.н., доцент кафедры  микробиологии, вирусологии, эпизоотологии  и ВСЭ Ковалева Е.Н.

Ульяновск – 2013г

Содержание:

Введение

Микроскопия (МКС) (греч. μικρός — мелкий, маленький  и σκοπέω — вижу) — изучение объектов с использованием микроскопа. Подразделяется на несколько видов: оптическая микроскопия, электронная микроскопия, многофотонная микроскопия, рентгеновская микроскопия, рентгеновская лазерная микроскопия и предназначается для наблюдения и регистрации увеличенных изображений образца.

Электронные пучки получили широкое практическое применение в приборах электронной микроскопии. Используя источники свободных электронов и различные типы линз, фокусирующих или дефокусирующих пучки электронов, сконструировано большое число аналогов оптических устройств. Электронный микроскоп является универсальным прибором позволяющим исследовать и анализировать микроструктурные характеристики твёрдых тел. Другой важной чертой получаемых с помощью электронного микроскопа изображений является их объёмность, обусловленная большой глубиной фокуса прибора. Он позволяет также исследовать объекты при очень малых увеличениях, что особенно важно при исследовании физических свойств твёрдых тел и в ряде других областей.

1. История

История электронной  микроскопии началась с теоретических  работ немецкого физика Ганса Буша о влиянии электромагнитного поля на траекторию заряженных частиц. В 1926 году он доказал, что такие поля могут быть использованы в качестве электромагнитных линз, [1], установив таким образом основополагающие принципы геометрической электронной оптики. В ответ на это открытие возникла идея электронного микроскопа и две команды - Макс Кнолл и Эрнст Руска из Берлинского технического университета и Эрнст Бруш из лаборатории EAG попробовали реализовать эту идею на практике. И в 1931 году Кнолл и Руска создали первый просвечивающий электронный микроскоп, [2].

После перехода в немецкую радиокомпанию Telefunken, для проведения исследований телевизоров на катодных трубках, Макс Кнолл разработал анализатор электронной трубки или «анализатор электронного пучка», который моделировал все необходимые характеристики сканирующего электронного микроскопа: образец располагался с одной стороны отпаянной стеклянной трубки, а электронная пушка с другой. Электроны, ускоренные напряжением от 500 до 4000 вольт, фокусировались на поверхности образца, а система катушек обеспечивала их отклонение. Пучок сканировал поверхность образца со скоростью 50 изображений в секунду, а измерение тока, прошедшего через образец, позволяло восстановить изображение его поверхности. Первый прибор, использующий этот принцип, был создан в 1935 году, [3].

В 1938 году немецкий специалист Манфред фон Арденне построил первый сканирующий электронный  микроскоп, [4]. Но этот аппарат ещё не был похож на современный РЭМ, так как на нём можно было смотреть только очень тонкие образцы на просвет. То есть это был скорее сканирующий просвечивающий электронный микроскоп (СПЭМ или STEM) — Фон Арденне, по сути, добавил сканирующую систему к просвечивающему электронному микроскопу. Кроме регистрации изображения на кинескопе, в приборе была реализована система фоторегистрации на пленку, расположенную на вращающемся барабане. Электронный пучок диаметром 0,01 мкм сканировал поверхность образца, а прошедшие электроны засвечивали фотопленку, которая перемещалась синхронно с электронным пучком.

 Первая микрофотография,  полученная на СПЭМ, зафиксировала  увеличенный в 8000 раз кристалл ZnO с разрешением от 50 до 100 нанометров. Изображение составлялось из  растра 400х400 точек и для его  накопления было необходимо 20 минут. Микроскоп имел две электростатические линзы, окруженные отклоняющими катушками.

В 1942 году, русский эмигрант, физик и инженер Владимир Зворыкин, работавший в то время в лаборатории Radio Corporation of America в Принстоне в  США, опубликовал детали первого сканирующего электронного микроскопа, позволяющего проанализировать не только тонкий образец на просвет, но и поверхность массивного образца. Электронная пушка с вольфрамовым катодом эмиттировала электроны, которые затем ускорялись напряжением 10 киловольт. Электронная оптика аппарата была составлена из трех электростатических катушек, а отклоняющие катушки размещались между первой и второй линзой. Чтобы обеспечить удобство размещения образца и манипулирования им в конструкции РЭМ, электронная пушка располагалась внизу микроскопа (у этой конструкции была неприятная особенность — риск падения образца в колонну микроскопа).

 Этот первый РЭМ  достигал разрешения порядка  50 нанометров. Но в это время  бурно развивалась просвечивающая  электронная микроскопия, на фоне которой РЭМ казался менее интересным прибором, что сказалось на скорости развития этого вида микроскопии, [5].

В конце 1940 годов Чарльз Отли, будучи председателем конференции  отдела проектирования Кембриджского  университета в Великобритании, заинтересовался электронной оптикой и решил объявить программу разработки сканирующего электронного микроскопа в дополнение к ведущимся в отделе физики работам над просвечивающим электронным микроскопом под руководством Элис Косслетт. Один из студентов Чарльза Отли, Кен Сандер, начал работать над колонной для РЭМ, используя электростатические линзы, но вынужден был через год прервать работы из-за болезни. Работу в 1948 году возобновил Дэннис МакМиллан. Он с Чарльзом Отли построили их первый РЭМ (SEM1 или Scanning Electron Microscope 1) и в 1952 году этот инструмент достиг разрешения 50 нанометров и, что наиболее важно, обеспечил трехмерный эффект воспроизведения рельефа образца - характерную особенность всех современных РЭМ, [6].

В 1960 году Томас Эверхарт и Ричард Торнли, изобретя новый детектор («детектор Эверхарта-Торнли»), ускорили развитие растрового электронного микроскопа. Этот детектор, крайне эффективный для сбора как вторичных, так и отражённых электронов, становится очень популярным и встречается сейчас на многих РЭМ.

Работы, которые велись в Кембриджском университете группой  Чарльза Отли в 60-е годы, весьма способствовали развитию РЭМ, и в 1965 году фирмой «Cambridge Instrument Co.» был выпущен первый коммерческий сканирующий электронный микроскоп — Stereoscan, [7].

2. Принцип работы

Разрешающая способность (способность различать тонкие детали) оптического микроскопа ограничена длиной волны фотонов видимого света. Наиболее мощные оптические микроскопы могут обеспечить наблюдение деталей  с размером 0.1-0.2 мкм, [8]. Если мы захотим увидеть более тонкие детали, необходимо сократить длину волны, которая освещает объект исследования. Для этого можно использовать не фотоны, а, например, электроны, длина волны которых намного меньше. Электронные микроскопы - результат воплощения этой идеи.

  Нижеследующий рисунок (рис.2.1) иллюстрирует принципиальную схему РЭМ: тонкий электронный зонд (электронный пучок) направляется на анализируемый образец. В результате взаимодействия между электронным зондом и образцом генерируются низкоэнергетичные вторичные электроны, которые собираются детектором вторичных электронов. Каждый акт столкновения сопровождается появлением электрического сигнала на выходе детектора. Интенсивность электрического сигнала зависит как от природы образца (в меньшей степени), так и от топографии (в большей степени) образца в области взаимодействия. Таким образом, сканируя электронным пучком поверхность объекта, возможно получить карту рельефа проанализированной зоны.

Тонкий электронный  зонд генерируется электронной пушкой, которая играет роль источника электронов, и фокусируется электронными линзами (обычно электромагнитными, иногда электростатическими). Сканирующие катушки отклоняют зонд в двух взаимоперпендикулярных направлениях, сканируя поверхность образца зондом, подобно сканированию электронным пучком экрана электронно-лучевой трубки телевизора. Источник электронов, электронные линзы (обычно тороидальные магнитные) и отклоняющие катушки образуют систему, называемую электронной колонной.

В современных РЭМ  изображение регистрируется в цифровой форме, но первые РЭМы появились в  начале 1960 годов задолго до распространения  цифровой техники и поэтому изображение  формировалось способом синхронизации  развёрток электронного пучка в  кинескопе с электронным пучком в РЭМ и регулировки интенсивности трубки вторичным сигналом. Изображение образца тогда появлялось на фосфоресцирующем экране кинескопа и могло быть зарегистрировано на фотопленке.

Рис.2.1. Принципиальная схема «исторического» сканирующего микроскопа. Начиная с 1980 года, кинескоп, синхронизированный с РЭМ, уступил место устройствам цифрового накопления изображений.

2.1 Взаимодействие электронов с веществом

 Электроны зонда  (пучка) взаимодействуют с материалом  образца и генерируют различные типы сигналов (рис.2.1.1): вторичные электроны, обратноотраженные электроны, Оже-электроны, рентгеновское излучение, световое излучение (катодолюминесценция) и т. д. Эти сигналы являются носителями информации о топографии и материале образца, [9].

Рис. 2.1.1. Виды взаимодействия электронов с веществом

2.2 Вторичные электроны

В результате взаимодействия с атомами образца электроны  первичного пучка могут передать часть своей энергии электронам образца. В результате такого взаимодействия может произойти отрыв электронов. Такие электроны называются вторичными. Эти электроны обычно обладают небольшой энергией (порядка 50 эВ). Часто электрон первичного пучка обладает энергией, достаточной для появления нескольких вторичных электронов.

Так как энергия вторичных электронов невелика, их выход возможен только с приповерхностных слоев материала (менее 10 нм). Благодаря небольшой кинетической энергии эти электроны легко отклоняются небольшой разностью потенциалов. Это делает возможным существенно повысить эффективность детекторов (собрать максимально возможное количество электронов) и получить высококачественные изображения с хорошим отношением сигнал/шум и разрешением лучше 1 нм. Количество вторичных электронов зависит от угла столкновения электронного пучка с поверхностью образца, т.е. от топографии. Поэтому сигнал вторичных электронов применяется для воспроизведения топографии образца, [9].

3. Устройство

Основа сканирующего электронного микроскопа — электронная  пушка и электронная колонна, функция которой состоит в формировании остросфокусированного электронного зонда средних энергий (200 эВ - 50 кэВ) на поверхности образца. Прибор обязательно должен быть оснащен вакуумной системой. Также в каждом РЭМ есть предметный столик, позволяющий перемещать образец минимум в трех направлениях. При взаимодействии электронов с объектом возникают несколько видов сигналов, каждый из которых улавливается специальным детектором. Соответственно, изображения, продуцируемые микроскопом, могут быть построены с использованием различных сигналов, часто нескольких сигналов одновременно (например, изображение во вторичных электронах, изображение в отраженных электронах, рентгеновское изображение (карта)).

РЭМ оснащаются детекторами позволяющими отобрать и проанализировать излучение возникшее в процессе взаимодействия и частицы, изменившие энергию в результате взаимодействия электронного зонда с образцом, [9]. Разработанные методики позволяют исследовать не только свойства поверхности образца, но и визуализировать информацию о свойствах подповерхностных структур.

Основные типы сигналов, которые генерируются и детектируются  в процессе работы РЭМ:

1. вторичные электроны (ВЭ или режим рельефа)
2. отражённые электроны (ОЭ или режим контраста по среднему атомному номеру)
3. прошедшие через образец электроны, в случае установленной STEM-приставки (используется для исследования органических объектов)
4. дифракции отражённых электронов (ДОЭ)
5. потери тока на образце (ПЭ или детектор поглощенных электронов)
6. ток, прошедший через образец (ТЭ или детектор прошедших электронов)
7. характеристическое рентгеновское излучение (РСМА или ренгеноспектральный микроанализ, ВДА или волнодисперсионный анализ)
8. световой сигнал (КЛ или катодолюминесценция).

Все возможные типы детекторов, установленные на одном приборе  встречаются крайне редко.

Детекторы вторичных  электронов - первый и традиционно устанавливаемый на все РЭМ тип детекторов. В этом режиме разрешающая способность РЭМ максимальна. Разрешение детекторов вторичных электронов в современных приборах уже достаточно для наблюдения субнанометровых объектов, [10]. Из-за очень узкого электронного луча РЭМ обладают очень большой глубиной резкости, примерно на два порядка выше, чем у оптического микроскопа и позволяет получать четкие микрофотографии с характерным трехмерным эффектом для объектов со сложным рельефом. Это свойство РЭМ крайне полезно для понимания поверхностной структуры образца. Микрофотография пыльцы (рис.3.1) демонстрирует возможности режима ВЭ РЭМ.

 Рис. 3.1. Микрофотография пыльцы.

Отражённые электроны (ОЭ) — это электроны пучка, отражённые от образца упругим рассеиванием. В зависимости от конфигурации детектора они могут отображать либо композицию (состав) образца, либо его топографию (рельеф поверхности). В композиционном режиме ОЭ часто используются в аналитическом РЭМ совместно с анализом характеристических спектров рентгеновского излучения. Поскольку интенсивность сигнала ОЭ напрямую связана со средним атомным номером (Z) облучаемой в данный момент электронным пучком области образца, изображения ОЭ несут в себе информацию о распределении различных элементов в образце. Например, режим ОЭ позволяет обнаружить коллоидные золотые иммунные метки диаметра 5-10 нм, которые очень тяжело или даже невозможно обнаружить в биологических объектах в режиме ВЭ. Микрофотография поверхности аншлифа металл-оксидной системы (рис.3.2) демонстрирует возможности режима ОЭ РЭМ. В топографическом режиме ОЭ могут использоваться в условиях, когда традиционные детекторы вторичных электронов не работают, как например в РЭМ с переменным вакуумом.

 Рис. 3.2. Микрофотография интерфейса между оксидной (темные поля) и металлической (светлые поля) составляющими.

Характеристическое рентгеновское  излучение генерируется когда электрон пучка выбивает электрон с внутренней оболочки одного из атомов образца, заставляя электрон с более высокого энергетического уровня перейти на нижний уровень энергии с одновременным испусканием кванта рентгеновского излучения. Детектирование спектра характеристического рентгеновского излучения позволяет идентифицировать состав и измерить количество элементов в образце.

4. Режимы работы

Обычно для получения  информации о структуре поверхности  используются вторичные и/или отражённые (обратно-рассеянные) электроны. Контраст во вторичных электронах сильнее  всего зависит от рельефа поверхности, тогда как отражённые электроны несут информацию о распределении электронной плотности. Поэтому обратно-рассеянные электроны, которые генерируются одновременно с вторичными, кроме информации о морфологии поверхности содержат дополнительную информацию и о составе образца. Облучение образца пучком электронов приводит не только к образованию вторичных и отражённых электронов, а также вызывает испускание характеристического рентгеновского излучения. Анализ этого излучения позволяет определить элементный состав микрообъёма образца (разрешение не лучше 1 мкм).

4.1 Детектирование вторичных электронов

В качестве детектора  вторичных электронов используется детектор Эверхарта-Торнли, позволяющий  эффективно собирать электроны с  энергией порядка 50 эВ.

4.2 Детектирование отражённых электронов

Многие РЭМ оснащены высокочувствительным полупроводниковым  детектором обратно-рассеянных электронов. Детектор смонтирован на нижней поверхности  объективной линзы либо вводится на специальном стержне под полюсный наконечник. Это позволяет путем выбора режима из меню получить изображения топографии поверхности, изображение в композиционном контрасте или в темном поле.

4.3 Элементный микроанализ

Для анализа элементного  состава применяется рентгеноспектральный микроанализ, в котором детектируется характеристическое рентгеновское излучение вещества, возникающее при облучении поверхности образца электронами. Существует энергодисперсионные (EDX) и волнодисперсионные (WDX) анализаторы.

4.4 Работа при низких ускоряющих напряжениях

Современные микроскопы способны работать при низких ускоряющих напряжениях, до 200 вольт. Приложение замедляющего потенциала позволяет уменьшать  ускоряющее напряжение до 10 вольт. Низкие напряжения имеют ряд преимуществ. При низком напряжении можно достичь состояние равновесия, когда количество электронов пучка поглощенных образцом равно количеству электронов эмитированных образцом. В этих условиях нанесение проводящих покрытий на образец не требуется. При низких напряжениях повреждение образца электронами пучка минимально, что важно для деликатных образцов. И, наконец, при низких напряжениях зона взаимодействия электронов пучка с образцом резко уменьшается, что ведет к существенному увеличению пространственного разрешения при работе с отраженными электронами и с рентгеновским излучением.

  4.5 Переменный вакуум

Часть современных микроскопов  оборудована вакуумной системой, способной поддерживать высокий (и  сверхвысокий) вакуум в электронной  колонне, и относительно плохой вакуум в камере образцов. В результате образец находится в хотя и разреженной, но достаточно плотной для нейтрализации поверхностного заряда, атмосфере (обычно состоящей из паров воды или азота). В результате диэлектрические образцы можно наблюдать без проводящего покрытия. Если микроскоп оборудован также и охлаждающим держателем образцов, то появляется возможность работы с влажными образцами и даже с водой. Например, можно наблюдать непосредственно в микроскопе за растворением и рекристаллизацией поваренной соли (или других кристаллов).

5. Разрешение

Пространственное разрешение сканирующего электронного микроскопа зависит от поперечного размера  электронного пучка, который, в свою очередь зависит от электронно-оптической системы, фокусирующей пучок. Разрешение также ограничено размером области взаимодействия электронного зонда с образцом. Размер электронного зонда и размер области взаимодействия зонда с образцом намного больше расстояния между атомами мишени. Таким образом, разрешение сканирующего электронного микроскопа не достаточно для отображения атомных плоскостей и даже атомов, в отличие от современных просвечивающих микроскопов. Тем не менее, растровый электронный микроскоп имеет ряд преимуществ перед просвечивающим микроскопом. Это - визуализация сравнительно большой области образца, исследование массивных объектов (а не только тонких пленок), набор аналитических методов, позволяющих измерять состав и свойства изучаемого объекта.

В зависимости от конкретного  прибора и параметров эксперимента, может быть получено разрешение от десятков до доли нанометра. На 2009 год наилучшее разрешение было достигнуто на микроскопе Hitachi S-5500 и составило 0.4 нм (при напряжении 30 кВ), [10].

Как правило, наилучшее  разрешение может быть получено при  использовании вторичных электронов, наихудшее - в характеристическом рентгеновском излучении. Последнее связано с большим размером области возбуждения излучения, в несколько раз превышающим размер электронного зонда. При использовании режима низкого вакуума разрешение несколько ухудшается.

6. Подготовка объектов 

Проводящие (металлические) образцы обычно не требуют специальной  подготовки, и могут быть непосредственно  помещены в камеру микроскопа. Если требуется, образцы могут подвергаться очистке. Для обозрения внутренней структуры и (или) использования микрорентгеноспектрального анализа могут быть приготовлены шлифы.

Порошки и наночастицы  наносятся на зеркального качества поверхности (стекло, пластик, слюда  и др.) в виде взвеси в воде или  органическом растворителе. После высыхания  жидкости образец может быть использован в микроскопе. Порошки с более крупными частицами могут наноситься на проводящий углеродный скотч.

Непроводящие образцы  обычно подвергаются напылению тонкого  проводящего слоя для снятия заряда и экранирования падающего пучка  от накопленного в объёме материала заряда. Для проводящих покрытий чаще всего используют углерод, золото или сплав золота с палладием. Первый полезен для рентгеновского микроанализа. Напыление золота или сплава на его основе позволяет получать микрофотографии с бо́льшим увеличением и контрастом (чаще всего без собственной визуализации). Если невозможно напыление пленки на образец, то возможно снятие зарядки с образца на вводимую в камеру атмосферу (обычно водяные пары или азот) или при работе при низких ускоряющих напряжениях.

Биологические образцы  должны быть химически зафиксированы, дегидрированы в сериях растворов  спирта или ацетона с увеличивающейся  от 30-50% до 100% концентрацией, затем спирт (или ацетон) должен быть удален из образца  в специальном аппарате, в котором спирт замещается на жидкую двуокись углерода, которая переводится в газообразное состояние посредством перехода через критическую тройную точку.

7. Применение

Растровые микроскопы применяются  как исследовательский инструмент в физике, электронике, биологии, фармацевцике, медицине, материаловедении, и т.д. Их главная функция - получение увеличенного изображения исследуемого образца и/или изображений образца в различных регистрируемых сигналах. Сопоставление изображений, полученных в разных сигналах, позволяют делать вывод о морфологии и составе поверхности.

8. Характеристики современного растрового микроскопа

Характеристики растрового электронного микроскопа Magellan™ XHR SEM

• Разрешение при оптимальной  рабочей дистанции

— 0.8 nm at 15 kV

— 0.8 nm at 2 kV

— 0.9 nm at 1 kV

— 1.5 nm at 200 V

• Разрешение в точке  схождения

— 0.8 nm at 15 kV

— 0.9 nm at 5 kV

— 1.2 nm at 1 kV

Основные мировые производители  сканирующих электронных микроскопов

Carl Zeiss Microscopy — Германия

FEI Company — США (слилась с Philips Electron Optics)

Hitachi — Япония

JEOL — Япония (Japan Electron Optics Laboratory)

Tescan — Чехия

KYKY — Китай

9. Список используемой  литературы.

1. Аваев, И.А. Электронные приборы: Учебник для вузов / И.А. Аваев, В.П. Демин, В.Н. Дулин. - Москва: «Энергоатомиздат», 1989. - 496 с.
2. Барыкина, Р.П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы / Р.П Барыкина, И.С Клименко, Г.И. Рукман. - Москва: Издательство МГУ, 2004. - 312 с.
3. Василевский, А.М. Оптическая электроника / А.М. Василевский, М. А. Кропоткин, В.В. Тихонов. - Ленинград: Энергоатомиздат, 1990, 176 с.
4. Клингель, Г.Б. Растровая электронная микроскопия / Г.Б. Клингель, Л.К. Энгель. -  Москва: «Металлургия», 1986. - 200 с.
5. Ковалев, А.И. Современные методы исследования поверхности металлов и сплавов / А.И. Ковалев, Г.В. Щербердинский. - Москва: «Металлургия», 1969. - 192 с.
6. Робертсон, Б. Современная физика в прикладных науках / Б. Робертсон. - Москва: «Мир», 1985, 272 с.
7. Савельев, И.В. Курс физики, т.3. / И.В. Савельев. – Москва: Наука, 1989. - 352 с.
8. Суворов, А. Л. Микроскопия в науке и технике / А.Л. Суворов. - Москва: Наука, 1981, 136 с.
9. Электронный ресурс: режим доступа http://ru.wikipedia.org