Основные направления генетической трансформации сои

Реферат на тему «Основные направления генетической трансформации сои»

Введение...................................................................................................................3

Понятие трансгенного растения.............................................................................4

Характеристика сои.................................................................................................6

Генетически модифицированная соя.....................................................................8

Заключение.............................................................................................................13

Список литературы................................................................................................15

Введение

Всю историю сельского хозяйства (около 10 000 лет) человек для своей пользы улучшал животных и растения. Вначале селекция была основана на явлении естественной генетической изменчивости, позже люди научились искусственно создавать комбинативную изменчивость (гибридизация), а в последние десятилетия - и мутационную (мутагенез). Принцип селекции всегда оставался неизменным - отбор ценных генотипов. К сожалению, кпд селекции очень низок - из тысяч и десятков тысяч исходных растений селекционер выводит всего один-два сорта.

В XXI столетии ситуации в сельском хозяйстве состоит в том, что отрасль, базирующаяся на использовании неограниченных и экологически безопасных ресурсах солнца и биосферы, оказалась в числе наиболее ресурсо- и энергорасточительных и природоопасных. Так, если бы все страны расходовали на 1 га сельхозугодий такое же количество ископаемой энергии, как в США и Западной Европе, то 80% мировых энергоресурсов пришлось бы тратить только на сельское хозяйство. Односторонняя, преимущественно химико-техногенная интенсификация земледелия в промышленно развитых странах, как, впрочем, и стихийная экстенсификация агропромышленного комплекса в странах СНГ и Восточной Европы, не позволяют перейти к ресурсосберегающим и экологичным технологиям.

Спасение сельского хозяйства и всего человечества в целом - это получение трансгенных растений. Вся работа с трансгенными растениями направлена на коренное изменение методов традиционной селекции – желаемые признаки получаются благодаря введению нужных генов непосредственно в растение вместо длительной работы по скрещиванию различных линий. Сложность такого подхода заключена в том, что в отличие от бактерий и дрожжей, растения, как и животные, являются многоклеточными организмами. Для получения продукта нужный ген должен находиться в каждой клетке организма, что достаточно сложно осуществить. В этом плане растения имеют одно важное преимущество перед животными: возможна их полная регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, способных давать семена, растений.

Одной из основных культур, получаемой методом генетической модификации - это трасгенная соя. Соя выращивается в качестве коммерческой культуры в 35-ти странах мира. Основные производители сои – США, Китай, Корея, Аргентина и Бразилия. Сою выращивают, главным образом, для получения семян. Она широко используется в пищевой и других отраслях промышленности и является одним из основных источников растительного масла и белка (в том числе для кормления животных).

Понятие "трансгенного растения"

Трансгенным (или генетически модифицированным) называется растение, в геном которого методами генетической инженерии перенесены гены (их называют "трансгенами") из других организмов. Процесс переноса называется генетической трансформацией. Основными преимуществами такой технологии по сравнению с традиционной селекцией являются: возможность переноса всего одного гена, что практически не затрагивает исходный генотип; возможность придания признаков, которые нельзя перенести путем скрещивания с близкородственными видами; значительное ускорение процесса получения новых генотипов.

Наиболее широко используемый метод трансформации - агробактериальный был разработан на основе природного процесса. Почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens способна инфицировать двудольные растения, вызывая опухоли - корончатые галлы. Как выяснилось, при этом происходят перенос и встраивание в растительный геном двух групп генов: продукты одних вмешиваются в нормальный метаболизм растения и способствуют разрастанию опухоли, а продукты других синтезируют опины, вещества, ненужные растению, но используемые в пищу бактериями. Ученые модифицировали агробактерии таким образом, что они вместо собственных переносят в растения гены, нужные человеку.

Впоследствии был разработан ряд других методов трансформации растительных клеток, из которых наибольшее распространение приобрел биобаллистический. Он используется чаще всего для генетической модификации однодольных растений, нечувствительных к агробактериям. В специальных установках микрочастицы золота или вольфрама с нанесенной на них ДНК ускоряют при помощи сжатого гелия, и они проникают в ДНК клеток мишени.

Признаки, которые возможно придать с помощью генной инженерии, весьма разнообразны и в основном ограничены только наличием соответствующих генов. Очень условно их можно разделить на три группы. К первой относятся признаки, интересные производителям: устойчивость к различным факторам окружающей среды - гербицидам, болезням, вредителям, засухе, засолению, улучшение минерального питания, повышение укореняемости. Вторая группа признаков представляет интерес непосредственно для потребителей - модификация вкуса и аромата плодов, увеличение продолжительности их хранения, изменение окраски цветков, бессемянность, улучшение питательной ценности растений. В третью группу входят растения-"биофабрики", способные синтезировать вакцины, ферменты, биополимеры и другие полезные вещества.

ДНК бактерий существуют не только в виде хромосом, но и в виде маленьких кольцевых молекул (плазмид). Бактерии Agrobacterium tumefaciens помимо прочих содержат плазмиды, вызывающие опухоли (Ti-плазмиды). На такой плазмиде среди прочих генов имеется так называемая область Т-ДНК, содержащая гены, отвечающие за образование опухоли на растениях и синтез опинов. Именно этот кусочек плазмиды агробактерии встраивают в ДНК растений. Выяснилось, что агробактерии в принципе способны переносить в растения любую ДНК, которая расположена в этом месте плазмиды. Поэтому в плазмидах, используемых в генно-инженерных целях, природные гены заменяют любыми другими, представляющими интерес для человека. Как правило, это два-три гена: целевой, который придает, например, устойчивость к насекомым; селективный, который придает устойчивость к определенным веществам (чаще всего - антибиотикам), что позволяет трансформированной клетке расти в питательной среде с антибиотиками, в то время как нетрансформированные клетки в ней гибнут; и иногда - репортерный ген, который позволяет качественно определить трансформированную клетку, например, по окрашиванию или свечению в ультрафиолетов ом свете.

В суспензию агробактерий, содержащих плазмиды с нужными генами, добавляют органы или ткани растений (экспланты), из которых проще всего регенерировать целые растения (чаще всего используются листья). Этот этап называется кокультивацией. Во время кокультивации агробактерии с помощью vir-белков переносят участок Ti-плазмиды и встраивают его в растительную ДНК.

Затем растительную ткань помещают на питательную среду, содержащую антибиотики. В этой среде выживают только те клетки, в которые агробактерии перенесли ген, придающий устойчивость к антибиотикам, то есть трансформированные. Условия и состав среды подобраны таким образом, что трансформированные клетки активно размножаются, образуя неорганизованную массу делящихся клеток (калллус), из которой регенерируют трансгенные растения. Полученные растения размножают и подвергают различным анализам сначала в пробирке, а потом - на полях и в теплицах. (http://www.biotechnolog.ru/ge/ge12_6.htm)

Характеристика сои

Культурная соя (Glycine Мах) — однолетнее растение, происходящее из Восточной Азии, вероятно, из северного Китая. На протяжении веков эта культура являлась важным источником пищевых белков для Восточной Азии, но только недавно (в начале XX в.) появилась, в частности, в Америке. Сухие семена сои содержат около 40% белков и около 20% масла.

К настоящему времени 80% всего растительного масла, производимого в Америке, представлено соевым, множество пищевых продуктов имеют в своем составе соевые добавки.

Соя — преимущественный самоопылитель (99%), хотя пчелы и собирают нектар с ее цветов. Анализ генетической структуры по биохимическим маркерам свидетельствует о большой чистоте сортов данной культуры.

Соевый белок — уникальный белок растительного происхождения, содержащий все незаменимые аминокислоты, что позволяет в достаточной степени обеспечить потребности в них различных возрастных групп населения. По сравнению с мясом, рыбой и птицей соя как поставщик белка обладает неоспоримым преимуществом: ее аминокислоты легче выделяются из пищевой массы и лучше усваиваются. В Поднебесной сою называют «китайской коровой», поскольку из нее изготовляют отличную альтернативу молоку животных. Соевое молоко — полноценный и целебный источник белка, не содержащий насыщенных жиров.

Соевые продукты вносят большой вклад в профилактику заболеваний сердечно-сосудистой системы, которые значительно ухудшают качество жизни миллионов граждан, особенно в пожилом возрасте. Результаты клинических исследований, проведенных в разных странах мира, показали существенное снижение концентрации холестерина и других жиров в крови при использовании в рационе добавок из соевых белков или перехода на них как на основной источник белка. (Наука и жизнь, 2003).

Из сои, основного продукта питания в Европе и Северной Америке, получают очищенное растительное масло; из него производят маргарины и жиры для приготовления пищи, а также используют для заправки салатов. Кроме того, сою добавляют в различные продукты питания, например, в сухое молоко, соусы и мясные продукты. Соевая мука служит в качестве добавки для корма животным. Более того, сою используют как субстрат для получения дрожжей и антител, а также в производстве мыла и дезинфицирующих средств. (Публикации ОЭСР по охране окружающей среды.., 2000).

Генетически модифицированная соя

В последние годы соя нашла более широкое применение в питании детей и взрослых и в лечебно-профилактическом питании. В связи с этим возникла необходимость в увеличении производства продуктов из соевых бобов, и здесь важную роль сыграла генная инженерия. Среди созданных в мире генетически модифицированных культур соя занимает доминирующее положение. Цель ее генетических модификаций — значительно повысить урожайность этой важной продовольственной культуры. Первое успешное введение генетически модифицированной сои, устойчивой к гербициду глифосату на мировой рынок было осуществлено биотехнологической компанией "Монсанто" в США в 1996 г. (Цитология и генетика, 2008). С тех пор созданы новые сорта сои, устойчивые к пестицидам и вредителям. По данным Министерства сельского хозяйства США, генетически модифицированная соя составляет более 80% от всей выращиваемой в этой стране и 55% от всей производимой сои в мире.

Как показывают результаты мониторинга за оборотом пищевой продукции, имеющей генетически модифицированные аналоги, проведенные Институтом питания РАМН, процент генетически модифицированной сои, представленной в России, колеблется от 20 до 40% в зависимости от региона. 99% генетически модифицированной сои на рынке составляет соя линии 40-3-2. Дальнейшие разработки в этой области связаны с созданием сои, обладающей улучшенной пищевой ценностью и вкусовыми качествами.

 Имеется много методов  трансформации сои Glycine max, L таких как:

1. биобаллистическая
2. кокультивирование каллусов с суспензией агробактерий 
3. с использованием зрелых или незрелых эксплантов 
4. использование различных агентов трансформации.

Однако эти методы имеют ряд существенных недостатков: они включают этапы культивирования клеток в культуре in vitro и регенерации растений, занимают 12-16 недель от изоляции экспланта до трансфера молодого растения в почву, позволяют получать слабые химерные растения с низкой эффективностью трансформации, применяются только для одного или ограниченного числа сортов сои, интродуцируют 1-2 генетические конструкции целевых генов устойчивости к болезням или вредителям (такие как фосфинотрицин, репортерные гены) – то есть позволяют получать ограниченный биотехнологический продукт первого поколения, а весь процесс создания трансгенов составляет 320-380 дней.

В последнее время получили развитие методы генетической трансформации растений с использованием пыльцы, яйцеклетки, зародышей, семян, других половых элементов, - натуральные и естественные, приближенные к половому размножению, или так называемые, методы germ-line генетической трансформации. Такие методы генетической трансформации сои занимают 90-120 дней – длину вегетационного периода сои от цветения до созревания, экономичны, позволяют получать здоровые растения, относительно эффективны.

Способ germ-line генетической трансформации сои с использованием прорастающих пыльцевых трубок позволяет избежать получения химерных неоднородных растений, генотип независим, экономичен, быстр, близок к естественному половому размножению, относительно эффективен. В трансформации используют ген desA12licBM3. Этот ген контролирует молекулярные механизмы устойчивости растений к абиотическим стрессам.

 Высокий уровень экспрессии данных генов в трансгенной сое подтвержден повышением урожая до 148%, увеличением содержания воды в листьях на 7-13%, содержания пролина в листьях на 11-39%, активизацией фермента супероксид дисмутазы на 85-110% в условиях засухи и на 40-200% в условиях низких положительных температур. Радикальное улучшение сельскохозяйственных культур, такое как генетическая инженерия устойчивости растений к абиотическим стрессам, необходимо для обеспечения продовольственной безопасности. Имеются два способа germ-line трансформации. Эти способы описывают Agrobacterium-зависимую germ-line генетическую трансформацию сои. (Improved cotyledonary node method..., 2005; Transformation of peanut with a soybean vspB promoter-uidA chimeric gene, 1998)

Первый спсоб основывается на доставке генов к индивидуальным клеткам свежевыросшей меристемы сои; данные клетки могут непосредственно индуцировать формирование наземной части побега, из которой вырастают трансгенные растения.

Второй способ основан на использовании естественных пыльцевых трубок для переноса в зиготу рекомбинантной ДНК интереса. Преимущества способов – отсутствие необходимости в этапах культуры тканей и регенерация растений, экономия времени, реагентов и средств, а также использование природных механизмов интродукции целевых генов, сходных с естественным половым размножением. Способ генетической трансформации сои с использованием прорастающих пыльцевых трубок позволяет избежать получения химерных неоднородных растений и дает высокий выход семян, сравнимый с контрольными нетрансформированными формами. (Soybean transformation via the pollen tube pathway, 2002; Soybean transformation via the pollen tube pathway, 2009)

Для получения трансгенной сои, устойчивой к абиотическим факторам разработана эффективная технология генетической трансформации сои посредством пипетирования рыльца пестика цветков агробактериальной суспензией с целевыми генами с использованием germ-line элементов – естественных пыльцевых трубок, прорастающих сразу после опыления и используемых в качестве вектора доставки рекомбинантной ДНК для интеграции в только что оплодотворенные, но еще не делящиеся клетки зиготы.

1. разработка способа germ-line генетической агробактериальной трансформации сои включает следующие основные этапы: разработку генетических конструкций целевых генов;
2. подготовку эффективной суспензии агробактерий с агентами трансформации;
3. оптимизацию стадии развития растения и цветка сои, подбор цветка и нодии, определение времени суток для успешного внедрения агробактерий с целевыми генами по пыльцевой трубке в зародышевый мешок и оплодотворения сои с участием целевого гена;
4. отработку техники нанесения агробактериальной суспензии с геном интереса на цветок;
5. молекулярно-биологическую детекцию интродукции трансгенов в геном сои в первом и втором поколениях;
6. определение продуктивности трансгенов и устойчивости к стрессовым факторам.

Относительное содержание воды в листьях трансгенов полученных методом germ-line генетической трансформации на 7-13% выше в условиях почвенной засухи по сравнению с поливом, в то время как у нетрансформированного контроля этот показатель  ниже на 8-19%.

Суммарное содержание хлорофилла в расчете на 1 г сырой массы и соотношение хлорофиллов a/b у трансгенов  выше и составляет 2,27–2,68, у контролей отношение хлорофиллов a/b  несколько ниже (1,95–2,42).

Содержание пролина в листьях трансгенов сои под действием стресса засухи по сравнению с контролем повысился на 11-39%. В благоприятных условиях полива содержание пролина как у контроля, так и у трансгенов составляет 0,17-0,18 мг/г сырой массы.

Таким образом, способ генетической трансформации сои с использованием естественных пыльцевых трубок обеспечивает трансфер (доставку) ДНК целевых генов с Agrobacterium t. путем подрезания рыльца пестика с последующим естественным опылением. Трансформированные семена получают непосредственно без предварительной подготовки клеточной культуры и регенерации растения. (Генетическая инженерия сои для улучшения устойчивости к абиотическим стрессам, 2013).

Заключение

Сегодня человек имеет уникальную возможность не только использовать растения, уже придуманные природой, но и придумывать и создавать что-то новое. Речь идет о генетической биотрансформации растений и создании трансгенных растений с уникальными свойствами, устойчивых к различным факторам. Для производства трансгенных растениях в этом вопросе человек не придумал ничего нового: он взял механизм переноса генов, который известен в природе, и применил его в лаборатории. Этот природный механизм связан с использованием почвенной бактерии – агробактерии – и ее способностью переносить свои генетические фрагменты в растительную ткань, в растительную клетку. И, более того, встраивать в геном растений. Странами, ведущими в производстве таких растений, являются США с Канадой и Аргентина с Бразилией. За ними подтягивается Китай и Япония

Одним из лидирующих растений, получаемой методом генетической трансформации является соя. Продукты из соевых бобов содержат уникальный полноценный белок, целый ряд витаминов, особую роль среди которых играет витамин Е, защищающий клетки от губительного действия свободных радикалов, минеральные вещества: железо, имеющее большое значение для кроветворения, калий, играющий важную роль в регулировании работы сердца, а также биологически активные вещества, способствующие профилактике целого ряда заболеваний. Основными  методами трансформации сои Glycine max, L являются: биобаллистическая трансформация, кокультивирование каллусов с суспензией агробактерий,    использование зрелых или незрелых эксплантов  и  использование различных агентов трансформации. Зарекомендованным методом в генетической трансформации стал способ germ-line генетической трансформации сои с использованием прорастающих пыльцевых трубок.

В целом успех генетической трансформации в значительной степени зависит от ряда параметров, к числу которых относятся правильный выбор эксплантов и хорошо разработанный метод регенерации из них растений.

Список литературы:

1. Li Z., Nelson R., Widholm J., Bent A. Soybean transformation via the pollen tube pathway. University of Illinois, Urbana.et al., 2009. Web site
2. Li Z., Nelson R.L., Widholm J.M., Bent A. Soybean transformation via the pollen tube pathway. Soybean Genet Newslett., 2002. - Vol. 29. - P. 1–11.
3. Paz M.M., Martinez J.C., Kalvig A.B., Fonger T.M., Wang K. Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium mediated soybean genetic transformation // Plant Cell Report. - 2005. - P. 206-213.
4. Wang A., Fan H., Singsit C., Ozias-Akins P. Transformation of peanut with a soybean vspB promoter-uidA chimeric gene: I. Optimization of a transformation system and analysis of GUS expression in primary transgenic tissues and plants // Physiol. Plant. -1998. – Vol. 102. - Р. 38–48.
5. Емец А. И. Биолистическая трансформация сои с использованием нового селективного маркерного гена устойчивости к динитроанилинам / А. И. Емец, В. В. Радчук, А. В. Пахомов // Цитология и генетика. - 2008. - № 6
6. Кершанская О. И. Генетическая инженерия сои для улучшения устойчивости к абиотическим стрессам / О. И. Кершанская; Институт биологии и биотехнологии растений КН МОН РК. - Алматы, 2013
7. Лебедев В. Миф о трансгенной угрозе / В. Лебедев // Наука и жизнь. - 2003. - № 11
8. Публикации ОЭСР по охране окружающей среды, здравоохранению и безопасности Серия «Гармонизация регуляторного надзора в области биотехнологии» Консенсусный документ по биологии сои Glycine max (L.) Merr. Париж, 2000
9. электронный ресурс [http://www.biotechnolog.ru/ge/ge12_6.htm]