Полимеразная цепная реакция

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮТЖЕТНОЕ  ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО  ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ  «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ  И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

 

Кафедра фундаментальной  и клинической биохими с лабораторной диагностикой

 

 

 

 

«Полимеразная цепная реакция»

 

                                                   

                                                      Выполнила:

                                                                                     студентка 2 курса

                                                                      лечебного факультета

                                                            Шутько Г.Т.

                                                      Проверили:

                                                                                      зав.кафедрой, заслуженный

                                                                                      деятель науки РФ,

                                                                                член-корреспондент РАЕН

                                                                    Гильмиярова Ф.Н.,

                                                                            клинический ординатор

                                                                Соловьева М.Ю.

 

 

 

 

 

 

 

                                                    Самара 2011

СОДЕРЖАНИЕ

 

1. Общие сведения о полимеразной цепной реакции

2. Принцип метода полимеразной цепной реакции

2.1 Компоненты реакционной смеси

2.2 Температурный режим

2.3 Принципы подбора прамеров

2.4 Эффект «плато»

3. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции

3.1 Качественный анализ

3.1.1 «Горячий старт», его использование.

3.1.2 Детекция молекул РНК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. ПОЛИМЕРАЗНАЯ  ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)

 

Полимеразная  цепная реакция - это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.

Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним  из наиболее выдающихся событий в  области молекулярной биологии за последнее  десятилетие. Это позволило поднять  медицинскую диагностику на качественно  новый уровень.

Впервые состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь  для постановки полимеразной цепной реакции, и основные принципы использования  праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) для получения копий ДНК были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году. Однако тогда еще не была продемонстрирована основная черта ПЦР - экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК как результат реакции.

В 1983 году Kary Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК в миллиарды раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.

В этот период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие  в гейзерах. Их ферментная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает  высокие температуры горячих  источников и сохраняет свою биологическую  активность вплоть до 95° С, что является необходимым условием для проведения полимеразной цепной реакции.

Результатом открытия ПЦР  стало почти немедленное практическое применение метода.

Перспективы практического  использования ПЦР-диагностики

В настоящее время наиболее быстро развиваются пять основных направлений  генодиагностики:

• Диагностика инфекционных заболеваний;
• Диагностика онкологических заболеваний;
• Диагностика лейкемий и лимфом;
• Диагностика рака груди;
• Диагностика генетических заболеваний;
• -Идентификация личности;
• -Трансплантация органов и тканей;
• Определение отцовства;
• Диагностика патогенов в пище.

 

 

_{2. Принцип метода  полимеразной цепной  реакции}

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий.

 

_{2.1 Наличие в  реакционной смеси  ряда компонентов}

 

Праймеры - пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Taq-полимераза - термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) - дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ) - "строительный материал", используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК;

Буфер - смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН;

Анализируемый образец - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, служащую мишенью для последующего многократного копирования (например, ДНК микроорганизмов). При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

 

_{2.2 Циклический  температурный режим}

 

Если в анализируемом  образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит  из трех этапов.

1. Денатурация. На первом этапе необходимо денатурировать ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95° С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. Этот процесс длится не менее 1 минуты.

2. Отжиг. На втором этапе температуру смеси понижают до 55°С праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Праймеры выбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.

Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.

После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3’-конца праймера.

3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы - 75°С, и начинается синтез комплементарной цепи ДНК, инициируемый 3’-гидроксильной группой праймера, с максимальной эффективностью.

Иногда, в случае близкого значения температуры отжига праймеров к температуре оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухстадийный цикл ПЦР, совместив две стадии - отжиг и элонгацию - в одной.

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно  повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных  копий фрагмента ДНК удваивается.

Фактически значение эффективности  отдельных циклов амплификации составляет, по некоторым данным, 78-97%. В случае присутствия в пробе ингибиторов  реакции это значение может быть намного меньше.

Все реакции проводят в  пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его  поддержание осуществляется автоматически. Каждый цикл обычно длится 3 - 5 минут.

Первый цикл. ДНК-мишень фланкирована определенными последовательностями. К образцу ДНК добавляют праймеры (Р1 и Р2), ДНК-полимеразу Tag и четыре дНТФ. Здесь каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3’-гидроксильной группы "её" праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют "длинными матрецами", именно на них будет идти дальнейший синтез. Эти цепи служат матрицами во втором раунде ПЦР.

Во втором цикле двухцепочечную ДНК, состоящую из исходной и новосинтезированной ("длинная матрица") цепей, вновь денатурируют, а затем отжигают с праймерами. При отжиге праймеры гобридизуются с комплементарными им участками как исходных цепей, так и "длинных матриц", синтезированных в первом цикле. В результате ферментативного синтеза на исходных цепях синтезируются "длинные матрицы", а на "длинных матрицах" - "короткие", с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймер, на другом.

В третьем цикле все  гетеродуплуксы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплецируются. При отжиге праймеры гибридизуются с комплементарными участками исходных цепей, а также "длинных" и "коротких" матриц. При ферментативном синтезе in vitro на исходных цепях синтезируются "длинные матрицы", а на "длинных" и "коротких" матрицах - только "короткие матрицы".

В послудующих циклах число "коротких матриц" становится все больше.

Таким образом, специфические  фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

 

_{2.3 Основные принципы  подбора праймеров}

 

При создании ПЦР-тест-системы  одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:

1. Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3’-концам праймеров, т.к именно с них начинает достраивать комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос. Это мешает оценке результатов реакции, т.к легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

2. Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т.е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.

 

_{2.4 Эффект "плато"}

 

Следует заметить, что процесс  накопления специфических продуктов  амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем  его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом "плато".

Термин эффект “плато”  используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации.

В зависимости от условий  и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения эффекта “плато”  влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции  на “плато". Этот момент может наступить  до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

 

_{3. Методы, основанные на полимеразной цепной реакции}

 

_{3.1 Качественный анализ}

 

Классический способ постановки ПЦР, принципы которого были изложены выше, нашел свое развитие в некоторых  модификациях, направленных на преодоление  ограничений ПЦР и повышение  эффективности прохождения реакции.

 

_{3.1.1 Способ постановки ПЦР с использованием “горячего старта"}

Чтобы уменьшить риск образования  неспецифических продуктов реакции  амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт" (“Hot-start”). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Дело в том, что в  зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к температуре плавления, праймер образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности и, таким образом, обеспечивает специфичность реакции.

Существуют различные  варианты реализации "горячего старта":

Внесение в реакционную  смесь Taq-полимеразы во время первого цикла после прогрева пробирки до температуры денатурации.

Разделение ингредиентов реакционной смеси парафиновой  прослойкой на слои (в нижней части - праймеры, в верхней - Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые смешиваются при расплавлении парафина (~65-75⁰С).

Использование моноклональных антител к Taq-полимеразе. Фермент, связанный моноклональными антителами, становится активным лишь после стадии первой денатурации, когда моноклональные антитела необратимо денатурируют и освобождают активные центры Taq-полимеразы.

Во всех перечисленных  случаях, даже если неспецифический  отжиг произошел до начала температурного циклирования, элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК денатурируют, поэтому неспецифические продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что обеспечивает образование специфического продукта амплификации.

 

_{3.1.2 Детекция молекул РНК}

Возможность использования  РНК в качестве мишени для ПЦР  существенно расширяет спектр применения этого метода. Например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирус инфлюэнцы, пикорнавирусы и т.д.) представлены именно РНК. При этом в их жизненных циклах отсутствует промежуточная фаза превращения в ДНК. Для детекции РНК необходимо в первую очередь перевести ее в форму ДНК. Для этого используют обратную транскриптазу, которую выделяют из двух различных вирусов: avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus. Использование этих ферментов связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, они термолабильны и поэтому могут быть использованы при температуре не выше 42° С. Так как при такой температуре молекулы РНК легко образуют вторичные структуры, то эффективность реакции заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Предпринимаются попытки обойти этот недостаток используя в качестве обратной транскриптазы термостабильную полимеразу, полученную из термофильного микроорганизма Thermus Thermophilus, проявляющего транскриптазную активность в присутствии Mn²⁺. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную так и транскриптазную активность.

Для проведения реакции обратной транскрипции в реакционной смеси  также как и в ПЦР должны присутствовать праймеры в качестве затравки и смесь 4-х дНТФ, как строительный материал.

После проведения реакции  обратной транскрипции полученные молекулы кДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР

 

_{Заключение}

 

В настоящее время метод  ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются  всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок  поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных  для выявления нуклеотидных последовательностей  различных микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с  каждым разом снижают себестоимость  ПЦР-анализа, делая его доступным  для широкого использования в  диагностических и лечебных целях.

Диагностика инфекционных заболеваний  является наиболее частым приложением  ПЦР в многопрофильных медицинских  учреждениях. Что касается более  широких возможностей ПЦР-исследований в медицине и смежных областях, то среди них можно упомянуть  следующие приложения.

1. Диагностика инфекций. Наиболее востребована ПЦР-диагностика  вирусов (главным образом, вирусов  гепатитов В и С, а также группы герпеса), а также возбудителей скрытых инфекций, передающихся половым путем (хламидиоз, трихомониаз, микоплазмоз и др.).

2. Судебно-медицинская экспертиза  и смежные области. Идентификация  личности подозреваемых и потерпевших  лиц по анализам ДНК. С этими  вопросами методически связаны  задачи установления отцовства  (материнства) или иного кровного  родства.

3. Онкология, онкогематология, трансплантология. Выявление специфических онкогенов и антионкогенов (особенно в диагностике лейкозов и лимфом), которое обычно проводится с образцами РНК из клеток больных. Из проб РНК с помощью обратной транскриптазы получают комплементарную ДНК, в которой и выявляют искомые онкогены, характерные для отдельных типов лейкозов и лимфом. Кроме того, при трансплантации костного мозга и внутренних органов необходима диагностика НLА-антигенов, которая сейчас проводится с применением мультиплексной ПЦР, выявляющей широкий спектр генов совместимости.

4. Медицинская генетика. Диагностика мутаций, характерных  для редких генетических заболеваний  (в т. ч. пренатальная диагностика и установление носительства данного гена у родителей); обнаружение частых генных вариантов, связанных с предрасположенностью к определенным заболеваниям. За последние 10 лет приобрели популярность методы выявления у больных различных генных вариантов (аллелей генов), определяющих повышенный риск тромбоза и побочных эффектов некоторых лекарственных препаратов. Также в последние 5 лет разработаны и активно применяются исследования генетически модифицированных продуктов питания на предмет соответствия существующим санитарно-гигиеническим нормативам.

Необходимо помнить, что, во-первых, метод ПЦР должен применяться  клиницистами осмысленно, и врач, решивший использовать ПЦР в своей, работе должен обладать определенными знаниями об особенностях и возможностях данного  метода. Во-вторых, между клиницистом  и ПЦР-лабораторией должна существовать тесная обратная связь, необходимая  для анализа сложных случаев  и выработки правильной диагностической  стратегии. В-третьих, ПЦР-анализ не является панацеей в диагностике и не заменяет существующие методы исследований, а  лишь дополняет их. И главное - ПЦР  не может заменить интуицию и аналитическое  мышление, которыми должен обладать врач, рассчитывающий на успех

Список использованной литературы

 

1. Щербо С.Н. ПЦР в клинической лабораторной диагностике: реальности и перспективы //Справочник заведующего КДЛ 2006. №10 с. 45-60

2. Чухловин.А.Б. Метод ПЦР в клинической лабораторной диагностике // Справочник заведующего КДЛ. 2008. №4 с.36-50

3. Веб-ресурс для специалистов клинико-диагностических центров http://www.primer.ru/