Виробництво ферменту глюкозооксидази

Вступ

Стан біотехнологічної галузі потребує великої уваги з  боку держави, тому що роль сучасної біотехнології  є вирішальною для становлення  економіки України, розвиток котрої базується на впровадженні високотехнологічних  виробництв. Залучення біотехнологічних розробок уможливлює розв’язання актуальних завдань сучасної медицини, сільського господарства, фармакології, екології, низки галузей промисловості [6].

Якщо розглянути фармацевтичний ринок України, то його структура  відрізняється від світового. В  Україні найбільший сегмент ринку займають пробіотики, вакцини і сироватки, а далі – білки крові, антибіотики, ферменти і потім генно-інженерні препарати. У медицині біотехнологічні прийоми і методи відіграють головну роль при створенні нових біологічно активних речовин і лікарських препаратів, призначених для здійснення ранньої діагностики та лікування різноманітних захворювань. Велика увага  приділяється виробництву ферментів [16].

 Ферменти – речовини  білкової природи, здатні каталізувати  різноманітні реакції перетворення речовини та енергії. Вони відіграють винятково важливу роль у процесах життєдіяльності організмів, здійснюючи обмін речовин, процеси їх асиміляції та дисиміляції. Але не тільки в організмі, а й виділені у чистому вигляді ферменти у певних умовах каталізують різноманітні перетворення, які мають велике значення у різних галузях практичної діяльності [17].

До сьогодні описано понад 3000 ферментів, проте лише кілька з них одержують  у промисловості. У мікроорганізмів  виявлено понад 1500 різних ферментів, причому в кожній клітині міститься в середньому 100 тис.  молекул ферментів. За останні 40 років майже всі нові ферментні препарати одержано за допомогою мікроорганізмів.

 Така «монополія»  ферментів мікробного походження  зумовлена високою швидкістю росту мікроорганізмів-продуцентів на доступних і відносно дешевих поживних середовищах, а також можливість модифікації ферментів  методами генетичної інженерії. Ферменти і ферментні системи можуть функціонувати in vitro, проте їх джерелом є живі організми, з певною генетичною програмою, тому фізіолого-біохімічні властивості продуцента визначають і характеристику біокаталізатора [16].

За даними 1990 р. [16] на світовому ринку комерційний оборот від реалізації технічних ферментних препаратів становив 800 млн доларів. 80 % усіх ферментів технічного призначення використовувались у таких трьох галузях, як гідроліз крохмалю – 40 %, виробництво детергентів – 30, виробництво сирів – 10 %. На сьогодні товарообіг промислово одержуваних ферментів становить понад 1 млрд доларів на рік. Як показує аналіз реалізації ферментів за останні 10 років, виробництво ферментів мікробного походження має тенденцію до зростання – в середньому 5-7 % на рік (деякі експерти називають цифри 10-15 % [16].

Актуальність  теми. Серед ферментів, які продукуються міцеліальними грибами, важливе місце займає глюкозооксидаза (𝛽-D-глюкоза, О₂ – оксидоредуктаза) (ГО), що каталізує окиснення 𝛽-D-глюкози до глюконової кислоти. Цей фермент використовується в багатьох галузях харчової промисловості, таких як: консервна, виноробна, м’ясна для вилучення кисню, що сприяє підвищенню стійкості продуктів тривалого зберігання і збереженню кольору. З застосуванням окремих прийомів за допомогою глюкозооксидази можна зберігати сир, свіжі м'ясо і рибу, борошно, крупи. Ефективним є використання глюкозооокидази для промислового одержання глюконової кислоти. Глюконова кислота (Е 574) використовується у світовій харчовій промисловості як регулятор кислотності і розпушувач, засіб, що інгібує мікроорганізми, як зв'язувальна речовина для іонів металів [3].

В останні роки широко застосовується ГО як аналітичний  реагент у клінічній діагностиці  і біосенсорних технологіях для  визначення глюкози у біологічних  рідинах, їжі і технологічних  процесах [1].

Перспективним напрямком використання ГО є розробка технології фруктово-овочевих нектарів лікувально-профілактичного призначення для людей з порушеним вуглеводним обміном – цукровий діабет другого типу. В основі лікування такого типу діабету покладена дієтотерапія, заснована на зниженні у раціоні харчування легкозасвоюваних вуглеводів. Найбільш прийнятним вуглеводом є фруктоза, що метаболізується у організмі людини без участі інсуліну. Розробка технології виробництва ферментного препарату глюкозооксидази та її використання при виробництві фруктово-овочевих нектарів з низьким вмістом сахарози і глюкози є актуальним [3].

Новизною є вибір штаму гриба Penicillium funiculosum KM МГУ 433 – продуцента  позаклітинної глюкозооксидази, що здатен синтезувати глюкозооксидазу за відсутності комплексних органічних сполук невизначеного складу [20].

РОЗДІЛ 2. Технологічна частина

2.1. Характеристика  кінцевої продукції – ферменту  глюкозооксидази

Препарати, що містять глюкозооксидазу

Застосування  цих препаратів пов’язане з необхідністю в певних випадках видаляти з продуктів глюкозу або кисень. Обробка продукту перед сушінням глюкозооксидазою дозволяє перевести глюкозу в глюконову кислоту, що виключає утворення підвищеного цвітіння в сухому продукті. Цей фермент частіше використовується у виноробстві, пивоварінні, консервній та безалкогольній промисловості для видалення кисню, що сприяє підвищенню стійкості продуктів до тривалого зберігання. Глюкозооксидаза застосовується разом з каталазою, так як їх каталітична активність взаємопов’язана. Реакція проходить за наступною схемою:

2С₆Н₁₂О₆ + 2О₂ + 2Н₂О            глюкозооксидаза           2С₆Н₁₂О₇ + 2Н₂О₂

                            2Н₂О₂              каталаза                    2Н₂О + О₂

                 2С₆Н₁₂О₆ + О₂         два ферменти                  2С₆Н₁₂О₇

Введення ферменту в напої в момент закупорювання  дозволяє повністю видалити з продукту та повітряного об’єму кисень, що сильно сповільнює окислення різноманітних  сполук та робить можливим розвиток мікроорганізмів. Цей фермент може наноситися у вигляді тоненького покриття на пергамент разом з необхідною кількістю глюкози та буферних солей. Герметична упаковка в такий пергамент, наприклад, вершкового масла запобігає згіркненню масла та його втрати при зберіганні. Волога, що виділяється з масла, розчиняє ферменти, буферні солі, глюкозу та кисень, що

знаходиться в  повітряному просторі між  маслом та пергаментом, розходиться на окислення  глюкози та повністю вживається. В  такій атмосфері масло може зберігатися  без утворення згірклого шару довгий час. Застосовуючи певні прийоми, за допомогою глюкозооксидази  та без кисневого середовища можна зберігати сир, сире м'ясо, рідкі концентрати, борошно, крупи, майонез, молоко і т.д. Очищені препарати глюкозооксидази можуть бути використані як лікувальний засіб для обробки ран та опіків.

Механізм дії та властивості  глюкозооксидази

Субстрат. Субстратом для глюкозооксидази є глюкоза. Цей фермент має високу специфічність по відношенню до субстрату. Він здатний окислювати 𝛽-D-глюкозу, проявляючи особливу подібність до другого та третього атома вуглеводу в молекулі 𝛽-D-глюкози. Під дією глюкозооксидази 𝛽-D-глюкоза перетворюється в глюконову кислоту [8].

Глюкозооксидаза відноситься до флавінових ферментів. Вона каталізує окислення глюкози за рахунок молекулярного кисню. Наявність ферменту, що каталізує пряме окислення глюкози за рахунок молекулярного кисню без виділення вуглекислого газу, була виявлена ще в 1904 р. М.А. Максимовим у відпресованій рідині з гриба Aspergillius niger. Він же відмічав те, що ці розчини підкислюються. Подальші дослідження підтвердили встановлений факт та показали, що поглинання кисню відпресованою рідиною з гриба в присутності глюкози пов’язане з утворенням глюконової кислоти. Д. Мюллер назвав цей фермент глюкозооксидазою. Пізніше було встановлено, що цей фермент – не справжня оксидаза, а дегідрогеназа, і оскільки акцептором водню є молекулярний кисень – глюкозоаерогідрогеназа [8].

Препарати, що отримувалися з грибів роду Penicillium мали активним початком глюкозооксидазу, використовувались в медицині як антибіотики та були відомі під назвою : нототин, пеніцилін Б, мікроцид. Пізніше було встановлено, що це фермент і що антибіотична дія пов’язана або з  у твореним перекисом водню, або з процесом споживання з реакційного середовища кисню.

Механізм дії. Механізм реакції, що каталізується глюкозооксидазою, вивчався багатьма дослідниками. Так як глюкозооксидаза відноситься до флавопротеїнів, які в своїй більшості є дегідрогеназами, було поставлене питання про те, яким же чином здійснюється окислення глюкози. Чи відбувається перенесення двох атомів водню від глюкози або її гідратно-альдегідної форми на молекулярний кисень, що є акцептором водню, або ж шляхом активації молекулярного кисню, в результаті чого один із кисневих атомів з’єднується з альдегідною групою глюкози, а другий взаємодіє з водою і утворює перекис водню. Для з’ясування цього механізму Р. Бентлей та А. Нейберг при вивченні культури P. notatum використовували мічені воду та кисень. Результати цих дослідів дозволили авторам прийти ло висновку, що досліджуваний фермент каталізує перенесення водню від глюкози на кисень. Так як в процесі цього переносу не спостерігається утворення вільного радикалу, вони вважали більш ймовірним перенесення двох електронів. Пізніше С. Нокамура та ін. (1967), використовуючи в своїх дослідах високо очищений фермент глюкозооксидазу P. amagasakiense на основі кінетичних досліджень встановили, що під час реакції флавінаденіндинуклеотидна (ФАД) група глюкозооксидази не перетворюється в скільки-небудь помітних кількостях в семихінон. Вчені, розбираючи загальні питання механізму реакцій, що каталізуються флавопротеїнами , прийшли до висновку, що картина загального механізму відновлення наступна : два водні переносяться у вигляді протонів, а субстрат утворює ковалентний зв'язок із системою кілець флавіну. Утворення та розщеплення цих проміжних сполук передбачає механізм транспорту електронів який відображає суть ферментативної реакції, що протікає. А відповідні місця розташування на поверхні білка кислих та основних груп забезпечують каталіз дегідрування та відповідають за швидкість ферментативних реакцій [8].

Вивчення кінетики глюкозооксидазної реакції дозволяє стверджувати, що в процесі каталізу ФАД-частина ферменту може знаходитися або в повністю окисненій, або в повністю відновленій формі. Таким чином, в найзагальнішому вигляді процес окислення 𝛽-D-глюкози глюкозооксидозаю можна виразити в два етапи. Спочатку   𝛽-D-глюкоза в присутності кисню перетворюється в 𝛿-глюконолактон. Другий етап реакції проходить самовільно без участі ферменту. В присутності води 𝛿-глюконолактон перетворюється в глюконову кислоту. Глюкозооксидаза, подібно іншим флавіновим ферментам не каталізує реакції безпосереднього окиснення субстрату молекулярним киснем. Замість цього відбувається перенесення атомів водню через проміжні зв’язки за участю ФАД, який грає роль простетичної групи у ферменті:

   𝛽 – D- глюкоза + ФАД                                 δ – Глюконолактон + ФАДН₂

                   ФАДН₂ + О₂                                                         ФАД + Н₂О₂

Із схеми  видно, що два атома водню переносяться на флавінову группу ферменту , а  лише потім – на молекулярний кисень. Глюкозооксидаза є складним ферментом, який складається з простетичної групи (дві молекули ФАД) і глюкопротеїду. У формуванні активного центру і просторової структури ферменту приймає активну участь простетична група глюкозооксидази. Багатьма дослідниками  висувається думка про те, що ФАД можна розглядати як місток між субодиницями в молекулі ферменту. Залишається й досі не до кінця зрозумілим те, чи являються молекули ФАД учасниками каталітичного акту та  входять в активний центр ферменту або жодна з них виконує роль стабілізатора структури ферменту [8].

При елекронно-мікроскопічному дослідженні кристалічних гомогенних препаратів глюкозооксидази, негативно контрастованих урамілацетатом, були виявлені крупні пачки трубоподібних утворень, укладених бік о бік, а також окремі труби діаметром близько 220 Å і товщиною стінок 50  Å. Труби можна розглядати як трубчасті кристали, стінки яких представляють монослої молекул. В стінках труб молекули укладені по спіралі з кроком близько 60 Å. На основі картини оптичної дифракції зроблений висновок  про те, що найбільш вірогідними є параметри спіралі, в якій на період повторення припадає 11 витків та 50 молекул. На профільних зображеннях при включенні у фільтрацію ближніх рефлексів молекули виглядають створеними з двох чітко різних половинок, кожна яких в свою чергу складається з двох субодиниць.

Фізично-хімічні  характеристики глюкозооксидази : спектр її поглинання – 𝜆_max  при 278/280, 380, 460 нм і 𝜆_min при 250, 320 і 410 нм. Відношення D₃₈₀ /D₄₆₀ в препаратах кристалічної глюкозооксидази дорівнює одиниці. Молекулярна маса ферменту, визначена методом світлорозсіювання, дорівнює 150 000 та константа седиментації – 7,8•10 ̄ ¹³ с ̄¹. Молекулярний коефіцієнт екстинції кристалічних препаратів глюкозооксидази при 460 нм дорівнює 2,20•10⁴ М ̄ ¹•см ̄ ¹. Ізоелектрична точка, визначена методом електрофокусування в ПААГ, знаходиться в області рН 4,7 – 4,8. Оптимальний рН для дії фермента знаходиться в інтервалі 5,6 – 5,8.

Термостабільність глюкозооксидази порівняно висока. Так, 15-хвилинне прогрівання розчинів кристалічної глюкозооксидази при температурі до 50℃ в діапазоні рН від 4,0 до 5,6 не знижує активності ферменту. Прогрівання ж при цих же умовах, але при температурі 56℃ викликає зниження активності на 10 – 12 %. Повна інактивація глюкозооксидази наступає при 15-хвилинній експозиції при температурі 70 ℃. Глюкозооксидаза наділена високою специфічністю, її молекулярна активність по відношенню до 𝛽-D-глюкози дорівнює 42 000 од./мл.

Іони ртуті  та міді в концентрації відповідно 10 ̄ ³ та 10 ̄ ⁵ знижують активність та термостабільність ферменту. Іони кальцію та амонію в концентрації , що перевищує концентрацію іонів ртуті на 1-2 порядки, захищають фермент від інгібуючої дії цими іонами [8].

Галузі застосування глюкозооксидази

 Застосування глюкозооксидази  для аналітичних цілей. Висока специфічність глюкозооксидази по відношенню до глюкози сприяла використанню цього ферменту в якості специфічного реактиву для визначення глюкози в крові та інших біологічних рідинах. Вперше глюкозооксидозу застосували для специфічного манометричного методу визначення глюкози. Потім Кетсонт описав швидкий і простий калориметричний спосіб визначення глюкози за допомогою глюкозооксидази та пероксидази. Завдяки високій специфічності глюкозооксидази по відношенню до глюкози цей метод дає можливість визначити «істинну» глюкозу в рідинах, які містять інші цукри, які при визначенні іншими методами (хімічними) визначаються як глюкоза. Препарати глюкозооксидази дають можливість визначати інші цукри, які наявні у досліджуваному об’єкті, наприклад галактозу, після попереднього окислення глюкози глюкозооксидозою. Глюкозооксидазний метод застосовується також для визначення мальтози і фруктози в рослинах [3].

Застосування глюкозооксидази  в харчовій промисловості. В наш час глюкозооксидаза знайшла застосування в харчовій промисловості для видалення глюкози із ряду продуктів або видалення кисню із продуктів, в яких його присутність призводить до їх псування, втрати аромату, кольору, смакових якостей.

Глюкозооксидоза виявилась ефективною для видалення  кисню з таких напоїв, як фруктові соки, пиво, яблучне вино, при приготуванні майонезу, при упаковці сухих харчових продуктів та ін. Видалення глюкози за допомогою глюкозооксидази застосовується при висушуванні яєць, які є продуктом зі значним вмістом глюкози. В яєчному білці міститься близько 3% глюкози на суху речовину, а в жовтці – 0,5%. Обробка яєць глюкозооксидазою попереджує небажане фарбування в період тривалого зберігання, яке могло з’явитися як результат реакції між глюкозою та аміногрупами білка. Глюкозооксидаза все ширше знаходить застосування при виготовленні майонезі. Відомо, що майонези, приготовані з високоякісної сировини, піддаються поступовому псуванню і через 3-4 місяці зберігання практично є непридатними до вживання. Додана до майонезу глюкозооксидоза, з розрахунку 50 мг % в період приготування, захищає від псування протягом 6 місяців, в той час як контрольні зразки майонезу без глюкозооксидази зіпсувались та згіркли через 3 місяці [3].

2.2. Характеристика біологічного агента

 2.2.1. Морфолого-культуральні ознаки

Міцелій Penіcillium funiculosum добре розвинутий, септований. Колонії на агарі Чапека ростуть повільно, спочатку білого, пізніше, рожевого кольору. Агар забарвлюється в тілесний відтінок. Поверхня дрібно пухнаста, вкрита червонуватими дрібними краплинами, край колоній досить широкий, рівнуватий. Діаметр становить 15-18 мм за 7 діб. Конідєєносці мають вигляд бокових відгалужених гіф, розміри яких становлять приблизно 200-250 мкм довжини та 2-3,5 мкм ширини. Гладенькі, з двохярусними верхівковими кісточками. Вітки більшої частини становлять 2-2,5 мкм. На сусло-агарі конідії спочатку білого кольору, з часом – червоно-бурого, поверхня оксамитова, за формою не досить щільні, з широкими білими краями. При старінні можуть набувати помаранчевого кольору або, навіть, коричневого. Колонії на середовищі Чапека з желатиною (20 %) та глюкозою ростуть обмежено, мають біло-рожеве забарвлення, переважають рожеві відтінки, оксамитові, з досить широкими білими краями, желатина забарвлюється в тілесний колір [5].

2.2.2. Фізіолого – біохімічні ознаки

Penіcillium funiculosum здатний отримувати енергію тільки шляхом дихання і тому потребує кисень, який є термінальним акцептором електронів при аеробному диханні. Отже, таким чином продуцент глюкозооксидази є облігатним аеробом. У зв’язку з цим міцелій гриба розвивається переважно у верхніх шарах субстрату і не проникає в його глибину. Потреба Penіcillium funiculosum у воді надзвичайно висока, але насичення водою пористого субстрату небажане, тому що при цьому повітря витісняється із пор і всередині утворюються анаеробні умови, що може призвести до загибелі продуцента. При меншому насиченні гриб проникає глибше і тримається довше на такому субстраті. За типом живлення Penіcillium funiculosum належить до хемоорганотрофних мікроорганізмів, оскільки джерелом енергії, вуглецю та донором електронів є органічні сполуки. Як і більшість інших грибів, Penіcillium funiculosum віддає перевагу кислому середовищу (4,0-5,0 ), тобто є ацидофілом. Проте у процесі росту змінює кислотність середовища до рН 3,0-3,2 це зумовлено виділенням глюкооксидази. По відношення до температури Penіcillium funiculosum є мезофілом. Температурний максимум для росту гриба коливається в межах 37-38 ⁰C, мінімум – в межах 30-32℃. Оптимальна температура для росту – 35-36℃. Світло не має особливого значення. Розвиток спостерігається як в темноті, так і на розсіяному світлі. Але чергування освітлення і темноти стимулює ріст гриба. Щодо розмноження, для Penіcillium funiculosum характерні такі способи розмноження як вегетативне (фрагментація гіфів, їх брунькування, а також утворення хламідоспор, які можуть проростати) та безстатеве розмноження конідіями. Статевого процесу немає, або він не виявлений [5,14].

2.2.3. Таксономічний статус 

Penіcillium funiculosum належить до вищих грибів, оскільки має септований міцелій.

Рід Penіcillium раніше розглядали як представника класу аскоміцетів, так і класу дейтероміцетів. За даними молекулярно – біологічних і генетичних досліджень, недосконалі гриби (Deuteromуcetes) не є самостійною таксономічною групою. Ними або втрачена статева стадія, або вони є аноморфами інших груп грибів ( ймовірніше класів Ascomycetes та Basidiomуcetes). У звязку з цим дейтероміцети повинні бути розміщені у відповідних класах грибів [5,17].

Згідно з  класифікацією грибів, яка була розроблена у 70-х – на поч. 80-х рр. XX ст. Penіcillium funiculosum займає таке положення у систематиці:

Царство – гриби( Fungi);

Відділ –  базидіальні(Basidiomуcetes);

Клас – дейтероміцети(Deuteromуcetes);

Порядок – гіфальні(Hiphales);

Сімейство – Phialosporoceae;

Рід – Penіcillium

Вид - Penіcillium funiculosum

Згідно сучасної класифікації Penіcillium funiculosum займає таке таксономічне положення : Eukaryota  <  Fungi  <  Dikarya  <  Ascomycota  <  Pezizomycotina  <  Eurotiomycetes  <  Eurotiomycetidae  <  Eurotiales  <  Trichocomaceae  <  mitosporic Trichocomaceae  <   Penіcillium  <  Penіcillium funiculosum [17].

2.2.4. Біотрансформація ростового субстрату в глюкозооксидазу

Синтез ферментів  складається із біосинтезу амінокислот  – складових білків та синтезу білка (транскрипція ДНК, трансляція мРНК).

Більшість мікроорганізмів  здатні синтезувати de novo всі 20 амінокислот, з яких складаються білки. Вуглецеві скелети амінокислот будуться з проміжних продуктів обміну, аміногрупи вводяться прямим амінуванням або транс амінуванням. Переведення неорганічного азоту в органічні сполуки завжди відбувається через аміак. Нітрати, нітрити, молекулярний азот (джерела азоту в поживних середовищах) і тільки після цього включаються до складу органічних сполук [16].

Лише небагато амінокислот утворюються в результаті прямого амінування вільними іонами амонію. У первинній асиміляції аміаку беруть участь L-глутаматдегідрогеназа та L-аланіндегідрогеназа, які здійснюють відновлювальне амінування 2-оксокислот (пірувату та 2-оксоглутарату). АТФ у цьому процесі участі не бере. Утворення глутаміну з глутамату каталізується глутамінсинтетазою і потребує витрат АТФ. За допомогою глутаматсинтази аміногрупа глутаміну може бути перенесена на 2-оксоглутарат з утворенням глутамату.

Решта амінокислот  отримує свою аміногрупу від первинних  амінокислот у результаті транс  амінування. З вільних амінокислот  у цитоплазмі кількісно переважає  глутамінова кислота (більше половини усього «пулу» амінокислот) [16].

Всі необхідні  для синтезу білків 20 амінокислот утворюються з певних метаболічних попередників. Субстратами для синтезу амінокислот є кілька сполук – піруват, оксалоацетат, 2-оксоглутарат, 3-фосфогліцерат, фосфоенолпіруват, еритрозо-4-фосфат і 5-фосфорибозил-1-пірофосфат. Оксалоацетат є відправною точкою для синтезу шести амінокислот, 2-оксалоглутарат – попередником синтезу чотирьох, а піруват – трьох амінокислот.

Аланін та аспартат синтезуються з пірувату та оксалоацетату  транс амінуванням з використанням  глутамату як донора аміногрупи. Аспарагін утворюється в реакції, що каталізується глутамінсинтетазою. Відновлення аспартату дає напівальдегід аспарагінової кислоти – попередник лізину, треоніну та метіоніну. Дезамінування треоніну приводить до утворення 2-оксобутирату, який в результаті послідовної дії ферментів перетворюється на ізолейцин. Під дією чотирьох ферментів піруват перетворюється на валін; проміжний продукт синтезу валіну служить попередником в утворенні лейцину. Серин, гліцин і цистеїн синтезуються з 3-фосфогліцерату, а пролін та аргінін – з глутамату [16].

Синтез ароматичних  амінокислот відбувається наступним  чином: еритрозо-4-фосфат і фосфоенолпіруват конденсується з утворенням С₇-сполуки, яка піддається циклізації. Проміжним продуктом синтезу є хоризмат. У цій точці біосинтетичний шлях розгалужується на два: утворення триптофану через антранілат; утворення тирозину та фенілаланіну через префенат.

2.3. Обгрунтування вибору технологічної схеми

Технологічна  схема,  що покладена в основу виробництва глюкозооксидази повинна забезпечувати найкраще поєднання виробничих заходів з точним дотриманням оптимальних умов проведення кожної виробничої стадії.

До кожної стадії виробницва  висувають  відповідні вимоги. Проект даного виробництва містить жорсткі вимоги до чистоти виробничих приміщень, де проходить технологічний процес виробництва глюкозооксидази, до роботи технологічного обладнання, вентиляції повітря, системи підготовки основної сировини і допоміжних матеріалів, виробничої санітарії, а також до самого обслуговуючого персоналу [21].

Санітарна підготовка виробництва. Стадія «Санітарна підготовка виробництва» - це одна із найважливіших стадій виробничого процесу, яка направлена на забезпечення чистоти виробництва. Мета такої підготовки - зведення до мінімуму механічних і мікробіологічних забруднень.

 Підготовка персоналу. Основним джерелом контамінації є персонал. Тому у виробничих приміщеннях під час роботи повинно знаходитися мінімальна кількість працюючих, що передбачено відповідними інструкціями [21].

Підготовка  приміщень. Основним напрямом санітарно-гігієнічної підготовки приміщень є забезпечення відповідної чистоти в приміщенні. Для цього на підприємстві проводиться щоденне та генеральне прибирання.

• щоденне прибирання, проводиться наприкінці зміни (вимикають вентиляцію, стіни двері й інші поверхні протирають губкою, змоченою дезінфікуючим розчином, потім цим розчином миють підлогу. Оброблені приміщення звільняють від персоналу і включають бактерицидні лампи. Не раніше, ніж через 30 хв. вмикають вентиляцію);

• генеральне прибирання проводять 2 рази на тиждень під час виробничого процесу та 1 раз на два тижні безпосередньо після обробки приміщення дезинфікуючими розчинами.

Підготовка  дезинфікуючих розчинів для дезінфекції приміщень. У випадку проведення дезинфекції застосовують декілька типів дезинфікуючих розчинів. Серед розчинів пропонуємо застосовувати:

-   розчин хлораміну (1%, 3%);

- розчин хлораміну  Б (1 – 3%). Розчин є бактерицидним та використовується проти вегетативних форм в концентрації 0,25 – 0,5% і температурі 30^оС, спороцидний – при 50 – 60^оС.

- розчин каустичної  соди (40%), який має властивості  дезінфікуючої речовини та детергента.

Миючі та дезинфікуючі засоби слід контролювати на мікробіологічну чистоту. Їх розчини потрібно зберігати у попередньо очищеній тарі та суворо дотримуватись строків зберігання. Дезрозчини мають відповідати таким вимогам: бактерицидна дія; хімічна стійкість; неушкодження поверхонь обладнання.

Підготовка  обладнання і комунікацій. Все технологічне обладнання у виробничих приміщеннях розміщується з урахуванням вимог, які пред'являються до сучасних виробництв.

До переліку операцій, що складають стадію підготовки обладнання входять миття водопровідною  водою, змиви дистильованою водою, обробка дезинфікуючим розчином, стерилізація парою, перевірка на герметичність виконання яких є невід'ємним для досягнення необхідного та бажаного рівня якості продукції [21].

Підготовка повітря. Основною метою підготовки вентиляційного повітря в даному проекті є забезпечення необхідної чистоти у виробничому приміщенні. Для одержання ферменту  глюкозооксидази необхідно проводити підготовку повітря у дві стадії, а саме: попереднього очищення повітря та тонкого очищення повітря.

Попереднє очищення повітря проводиться через фільтр ФЯВ для вилучення механічних забруднень.

Тонке очищення повітря від пилу і мікроорганізмів здійснюють на фільтрах ФТОВ (фільтри тонкого очищення повітря) типу НЕРА, ефективність роботи яких 98 %.

Забір повітря. Система забору повітря з атмосфери розташовують в місцях з мінімальним забрудненням.

Видалення механічних забруднень. Для видалення основної маси механічних домішок, попередження образивного зносу обладнання необхідною є наявність в технологічній схемі відповідного ступеню очищення. В якості фільтрів можуть бути використані мішечні фільтри, фільтрувальні матеріали з синтетичних тканин (нп. вініпласт, синтетичні волокна та ін..).