Федеральное агентство по образованию

      Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального  образования 

Уральский государственный  университет им. А.М. Горького 
 

Биологический факультет

Кафедра физиологии и биохимии растений 
 

АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА 
 

                                                                                                         Курсовая работа

       студентки 3 курса

       Спицыной  Исаны Сергеевны 
 

       Научный руководитель:

       Доктор  биол. наук, доцент

       Некрасова Галина Фёдоровна 

                                          Екатеринбург, 2009

                                         ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение………………………………………………………………………….4

Глава 1. Действие АФК на растительную клетку…………………………….6

               1.1. АФК как нормальный биологический процесс……………….6

               1.2. АФК при стрессовых факторах………………………………...7

               1.3. Роль тяжелых металлов в окислительном стрессе…………...10

Глава 2. Образование АФК в клеточных структурах……………………....11

Глава 3. Защита и пути нейтрализации АФК………………………………..15

Глава 4. Полезные эффекты образования АФК……………………………..20

Выводы………………………………………………………………………….23

Список  литературы…………………………………………………………….24

Приложения…………………………………………………………………….26

                                        Список сокращений

АФК - активные формы кислорода

ОМ - оксидативная модификация

АОС - антиоксидантная система

СОД - супероксиддисмутаза

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

ЭПР - электронно-парамагнитный резонанс

ГЦ - градус цельсия

ГПО - глутатионпероксидаза

ГТ - глутатионтрансфераза 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

                                                Введение

           Основное количество О2 расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм субстратов.Относительно небольшая часть переходит в АФК и затем частично используется для ОМ.АФК химически очень агрессивны: они повреждают белки и ДНК и, главное, вызывают ПОЛ- самоподдерживающийся процесс, ведущий к тяжелому повреждению мембран.К АФК относятся супероксид (O2), синглетный кислород, Н2О2 и радикал гидроксила (ОН') (приложение, таблица 1.).Несмотря на постоянное внимание ученых, уделяемое разным аспектам этой проблемы, до сих пор остаются нераскрытыми некоторые вопросы:

1) какое  значение имеют АФК и ОМ макромолекул - это просто утечка с главного пути использования О2 или важные процессы, но тогда они полезны или вредны;

2) как  осуществляется мощный метаболизм  АФК и активных окисленных  молекул и почему это нужно? (Полесская О.Г., 2007; Кулинский В.И., 1999)

     Актуальность этой проблемы возрастает в связи с чрезвычайно интересной двойственной ролью АФК в метаболизме растительной клетки.С одной стороны, АФК являются опасными окислителями, которые образуются как побочные продукты в результате тех или иных сбоев в нормальном метаболизме.С другой стороны, клетка имеет ферментные системы, которые специально образуют АФК, что позволяет под контролем повышать уровень опасных молекул (Полесская О.Г., 2007).

     Для принятия обоснованных решений  в физиологии и молекулярной биологии растений, необходимы точные представления о закономерностях воздействия АФК на растения.Анализ значения АФК и ОМ для жизнедеятельности растений должен опираться на знания о механизмах образования и ликвидации АФК в клетке, а также участия АФК в ответных реакциях растений при различных абиотических стрессах.

     Важное значение приобретают АФК в индукции программируемой клеточной смерти и в регуляции некоторых физиологических процессов, которые находятся под гормональным контролем.Особого внимания заслуживает развитие окислительного стресса в результате резкого увеличения концентрации АФК при неблагоприятных условиях (Полесская О.Г., 2007).

     Образование избытка кислородных  радикалов - большая проблема, для решения которой необходимо полное представление о роли АФК в организме.

     Цель данной работы – анализ  и обобщение литературы по  АФК для использования полученных  знаний в практической деятельности.

     Задачи:

- Изучить  влияние АФК на растения;

- Показать  роль АФК;

- Изучить процессы образования АФК в клетке и отдельных компартментах;

- Изучить  механизмы защиты клеток от  АФК;

- Изучить  влияние тяжелых металлов на  продукцию АФК;

- Показать  пути ликвидации АФК в клетке.

            Глава 1. Действие АФК на растительную клетку

     Действие АФК на клетку включает в себя следующие аспекты:

- стимуляция  митоза;

- блокирование  межклеточных коммуникаций, препятствующее апоптозу;

- освобождение  из ферритина ионов железа, катализирующих  образование гидроксирадикалов;

- высвобождение  свободной арахидоновой кислоты  из мембраны с последующим  ее метаболизмом на цитохроме  Р-450 с образованием высокоактивных  метаболитов (Кулинский В.И., 1999).

1. АФК как нормальный биологический процесс

     АФК вызывают в липидах (L), в основном в остатках полиненасыщенных жирных кислот, цепные реакции с накоплением липидных радикалов L’, пероксилов LOO’, гидропероксидов LOOH и алкоксилов LO’:

         +HO’       +O2             +LH

LH                 L’          LOO’            L’            …

         -H2O                          +Fe2+           +LH

                                   LOOH             LO’                 L’               …

                                              -Fe3+         -LOH

                                              -HO- 

     Первые три реакции - это инициация и продолжение цепи, а реакция LOOH c Fe2+ создает ее разветвление. Далее образуются диеновые конъюгаты, а затем минорные метаболиты: малоновый диальдегид, этан, пентан и др. (Владимиров Ю.А. и др., 1991; Владимиров Ю.А. и др., 1972). На протяжении многих лет ПОЛ считали преимущественно спонтанным (неферментативным) и неспецифическим самоускоряющимся процессом и ему придавали ведущее значение в ОМ и ее последствиях.  
 

Однако  затем стало ясно, что:

1) огромное  значение имеют и ферментативные реакции, катализируемые липоксигеназами (Ланкин В.З., 1984) и циклооксигеназами - первыми ферментами путей, приводящих к образованию специфических регуляторов – эйкозаноидов (Варфоломеев С.Д., 1996; Кулинский В.И., 1994; Сала А. и др., 1998);

2) в  организме главными продуктами  ПОЛ являются 4-гидроксиалкенали  типа С5Н9-СНОН-СН=СН-СНО, то есть  снова специфические вещества;

3) большое  значение имеет ОМ и других  макромолекул - ДНК и белков, усиленно  изучаемая в 90-е годы (Wiseman H. et al., 1996; Dean R.T.,et al., 1997).

     АФК вызывают ОМ нуклеотидов и нуклеиновых кислот, особенно ДНК. Это приводит к гидропероксидам ROOH (так, из тимина образуется 5-СН2ООН-урацил), а затем к гидроксипроизводным ROH или R(OH)2 , основными из которых являются 8-ОН-2'-дезоксигуанозин и тимингликоль (Wiseman H. et al., 1996). ОМ белков также вызывает образование в организме ROOH, а затем ROH (o- и m-тирозины), R(OH)2 (ДОФА), карбонилов и других окисленных производных; образуются и димеры (дитирозины); происходит также аутооксидативное гликозилирование белков (Dean R.T. et al., 1997).

1.2. АФК при стрессовых  факторах 

     Стрессы разной природы (абиотические-засуха,засоление, экстремальные температуры и биотические-болезни растений, нападение насекомых-вредителей) интегрируются в растительной клетке таким образом, что провоцируют сверхпродукцию АФК и развитие окислительного стресса, при котором механизмы образования, и, главное, роль АФК существенно отличаются от бесконтрольного образования АФК в результате сбоев в метаболизме, спровоцированных абиотическими стрессовыми факторами.

Существуют  симптомы и общепринятые тесты, характеризующие  степень окислительного стресса  в растительных клетках. Для определения интенсивности образования супероксидрадикала используется метод ЭПР или биохимические тесты. Показателем окислительного стресса может служить содержание в клетках перекиси как наиболее стабильного АФК. Часто степень окислительных повреждений оценивают по накоплению в растительных тканях малонового диальдегида (Полесская О.Г., 2007).

     В листьях симптомами и показателями окислительного стресса могут служить нарушения в работе фотосинтетического аппарата, эффект фотоингибирования, связанный со снижением скорости фотосинтеза, разрушение хлорофилла (Полесская О.Г., 2007).

     Практически при всех абиотических  стрессах наблюдается интенсивное образование АФК в хлоропласте, митохондриях, пероксисомах апопласте. При продолжительном действии на растение стрессовых факторов уровень АФК повышается во многих компартментах, в клетке накапливается перекись, и окислительный стресс охватывает всю клетку. На начальных этапах действия стресса иногда удается зафиксировать, что  образование АФК начинается в одном из компартментов. Очень часто причиной развития окислительного стресса являются именно те факторы, которые провоцируют дисбаланс между поглощением световой энергии и возможностью ее реализации. Когда растение сталкивается с водным дефицитом, всегда происходит закрытие устьиц и ограничение фиксации СО2. Это способствует генерации синглетного кислорода в антенных комплексах, а также-супероксидрадикала в ЭТЦ (Полесская О.Г., 2007).

     Окислительный стресс в листьях  могут вызывать и высокие концентрации  солей. При этом, высокий уровень АФК наблюдается как в хлоропластах, так и в других компартментах (Hernandez et al., 1993; Meloni et al., 2003; Mittova et al., 2003).

     У гороха при засолении образование супероксидрадикала усиливается в пероксисомах и митохондриях листьев, а содержание митохондриальной Mn-СОД снижается (Hernandez et al., 1993).

     Окислительный стресс может быть спровоцирован низкими положительными температурами (+4…+5 ГЦ), особенно на фоне относительно высокой интенсивности света. При низких температурах накопление перекиси наблюдается как в хлоропластах, так и в митохондриях (Полесская О.Г., 2007).

     Окислительный стресс может быть  вызван атмосферными вещестами,  наиболее опасным из которых  является озон. При повышенном уровне О3 в атмосфере на листьях чувствительных растений (табак, хвойные) появляются некрозы. Озон проникает внутрь листа через устьица и, реагируя с водой и компанентами клеточных стенок, провоцирует образование в апопласте синглетного кислорода, супероксидрадикала, Н2О2 и, вероятно, гидроксилрадикала. Предполагается, что образованные в апопласте АФК повреждают плазмалемму, в результате чего возникают повреждения, провоцирующие образование АФК уже внутри клеток. Вслед за окислительным взрывом в апопласте сверхгенерация АФК начинается в клетке, главным образом в хлоропластах. Поэтому вызванные озоном повреждения листьев проявляются в первую очередь в дезорганизации фотосистемы II, снижении активности и экспрессии Рубиско, деградации хлорофилла (Полесская О.Г., 2007).

     В последнее время широко изучается  действие на растения избытка  УФ-В-радиации (280-340 нм), которое приводит к изменениям в морфологии и метаболизме. Наиболее явная реакция-накопление в клетках эпидермиса фенольных соединений (флавоноидов, антоцианов), поглощающих в УФ-области. Такая защита препятствует проникновению УФ-излучения во внутренние слои клеток.

Избыточные  дозы УФ-В провоцируют в листьях сверхобразование АФК и окислительный стресс, связанный с деградацией реакционного центра фотосистемы II, падением уровня хлорофилла и каратиноидов, снижением синтеза Рубиско, изменением структуры хлоропластов, разрушением мембран. Сверхпродукция АФК начинается также в апопласте, и только потом охватывает хлоропласт (Полесская О.Г., 2007).

1.3. Роль тяжелых металлов в окислительном стрессе

     Окислительный стресс может возникнуть в листьях растений на фоне высокого содержания в почве ионов тяжелых металлов или органических ксенобиотиков (Полесская О.Г., 2007).

     Наиболее токсичными для растений являются ионы кадмия, цинка, меди, железа, алюминия, никеля. Причинами окислительного стресса здесь являются одновременное диффузное токсическое действие ионов  на многие ферментные системы  и мембраны, а также снижение эффективности антиоксидантных систем вследствие отвлечения восстановленного глутатиона на другие цели. Известно, что детоксикация тяжелых металлов происходит в результате их коньюгации с фитохелатинами, которые синтезируются на основе глутатиона. При поглощении органических ксенобиотиков (например, гербицидов) одной из причин окислительного стресса может быть процесс их детоксикации. К образованию супероксидрадикала ведет активация цитохром Р-450-монооксигеназной системы, которая модифицирует ксенобиотик. Затем, после модификации происходит коньюгация ксенобиотика с ГSH, которую катализируют ферменты глутатион-S-трансферазы. Синтез этих ферментов активируется не только при поглощении растениями инородной органики, но и при стрессах, вызванных озоном, поранением, действием тяжелых металлов и при атаке патогена. 

Возможно, коньюгация с глутатионом необходима для детоксикации соединений, образованных при разрушении мембран, хлорофилла и других клеточных компартментов (Полесская О.Г., 2007).

             Глава 2. Образование АФК в клеточных структурах

           АФК генерируются во всех частях клетки. Наибольший вклад вносит дыхательная цепь митохондрий, особенно при низкой концентрации АДФ. Важна роль и системы цитохрома Р-450, локализованной в эндоплазматической сети. Участвуют ядерная мембрана и другие части клетки, при этом АФК часто возникают не только спонтанно, но и ферментативно (НАДФН-оксидаза дыхательного взрыва в плазматической мембране и ксантиноксидаза в гиалоплазме). Концентрации АФК в тканях невысоки: Н2О2-10-8 М, cупероксидрадикал -10-11 М, НО’ < 10-11 М. АФК вызывают образование органических гидропероксидов ROOH - ДНК, белков, липидов, а также малых молекул (Владимиров Ю.А. и др., 1991; Владимиров Ю.А. и др., 1972). ROOH (липиды) образуются и в реакции с обычным молекулярным О2 при участии ферментов диоксигеназ или циклооксигеназ:

RH + O2 ROOH.

     ROOH по своей структуре подобны Н2О2 (R-O--O-H и Н-О-О-Н) и химически тоже активны, при последующем метаболизме они переходят в спирты, альдегиды, эпоксиды и другие окисленные соединения (Кулинский В.И., 1999).

     Образование ROOH называют перекисным окислением (пероксидацией).

     В хлоропластах постоянно образуются синглетный кислород, супероксидрадикал и перекись водорода, что связано с процессами фотосинтеза, протекающими в тилакоидной мембране. Образование синглетного кислорода (‘О2) происходит в результате контакта О2 с хлорофиллом, который поглотил свет и оказался в триплетном возбуждённом состоянии.

В процессе электронного транспорта часть электронов может перехватываться кислородом из ЭТЦ с образованием супероксидрадикала . По некоторым данным, при насыщающей интенсивности света около 10-25% общего нециклического электронного потока может идти на образование супероксидрадикала (Полесская О.Г., 2007).

     Для пероксисом характерна метаболическая  пластичность, так как их метаболизм  во многом определяется типом  клетки, в которой они находятся. Но во всех пероксисомах образуется и накапливается перекись водорода, синтез которой может быть связан с разными процессами (Полесская О.Г., 2007).

     Главную роль в образовании Н2О2 играет рибулезо-1,5-бисфосфат карбоксилазы/оксигеназы (Рубиско) (Физиология растений, 2005. С. 190-202). Этот фермент осуществляет как оксигеназную, так и реакцию карбоксилирования. Оксигеназная функция Рубиско приводит к образованию гликолата, который транспортируется в пероксисомы и окисляется гликолатоксидазой до глиоксилата с образованием Н2О2 (Полесская О.Г., 2007).

     Помимо этих процессов в пероксисомах  возможны и другие, в которых  образуются АФК. Пероксисомы, как и хлоропласты и митохондрии, продуцируют синглетный кислород в ходе нормального метаболизма. Показано, что в матриксе пероксисом из листьев гороха и семядолей растения Citrullus vulgaris образование супероксидрадикала происходит при окислении ксантина ферментом ксантиноксидазой. Образованный синглетный кислород трансформируется в Н2О2, так как в пероксисомах присутствуют CuZn-СОД и Mn-СОД (Полесская О.Г., 2007).

     В цитозоле образование АФК может быть связано с протеканием некоторых биохимических реакций. Так, образование Н2О2 возможно в реакциях, катализируемых флавиновыми оксидазами.

Образованием  перекиси сопровождается окисление  аминокислот при участии соответствующей  оксидазы:

R-NH2+O2+H2O       R=O+NH3+H2O2

     В цитозоль может быть обращено образование супероксидрадикала при функционировании ферментных систем на мембранах пероксисом. Возможен выброс в цитозоль синглетного кислорода, образованного на комплексах дыхательной цепи  во внутренней мембране митохондрий.

     Кроме того, образование синглетного кислорода связано с работой сложного ферментного комплекса, который называется цитохром Р-450-зависимой монооксигеназой. Монооксигеназная система осуществляет первичную модификацию разнообразных сложных молекул, включая в их структуру атом кислорода. В ходе этой реакции часть электорнов может уходить не по назначению, а перехватываться кислородом с образованием супероксидрадикала (Полесская О.Г., 2007).

     Основными источниками АФК в  клетке являются митохондрии. Вызванные АФК повреждения  и мутации в митохондриальной ДНК, накапливаясь в течении жизни, становятся причиной старения-в этом заключается суть свободнорадикальной теории старения (Полесская О.Г., 2007). В митохондриях образование супероксидрадикала, а затем и перекиси водорода сопряжено с функционированием дыхательной ЭТЦ во внутренней  митохондриальной мембране (Физиология растений, 2005. С. 233-260). В дыхательной цепи происходит окисление НАДН, образованного в результате биохимического окисления глюкозы, и восстановление О2 до воды. В составе дыхательной цепи есть четыре трансмембранных белковых комплекса и АТФ-синтаза. Каждый из комплексов состоит из многих белковых субъединиц.  
 

Переносчики электронов входят в состав комплексов и содержат простетические группы, или редокс-центры, которые формируют  пути переноса электронов (железосерные кластеры, гемы цитохромов и связанные на комплексах убихиноны). Работа цепи начинается с окисления НАДН на комплексе I (НАДН-дегидрогеназа) и сопровождается переносом 2е- на убихинон (Q), который восстанавливается до убихинона (QH2).

      Важной особенностью растительных митохондрий является присутствие в цепи альтернативной оксидазы (АОХ), которая окисляет QH2 и восстанавливает О2 до воды, конкурируя с комплексом IV. Интенсивность генерации супероксидрадикала усиливается при увеличении пула восстановленного убихинона и особенно активно протекает на комплексах I и III. Электронный транспорт в этих комплексах связан с образованием семихинон-радикалов (Полесская О.Г., 2007).

     Генерация супероксидрадикала в митохондриях становится более интенсивной, если электронный транспорт в цепи тормозится в силу дыхательного контроля. Ускоряет электронный транспорт  частичное разобщение с фосфорилированием с помощью жирных кислот и UCP-белков, а также активация альтернативной оксидазы (Полесская О.Г., 2007).

     Стрессовые факторы ведут к  нарушению функций митохондрий,  в которых усиливается продукция супероксидрадикала и начинает накапливаться Н2О2, которые атакуют комплексы I, II, III и АТФ-синтазу. В результате, повреждению АФК подвергаются многие ферменты, функционирующие в матриксе митохондрий (Полесская О.Г., 2007). 
 
 
 
 

             Глава 3. Защита и пути нейтрализации АФК

     Защита осуществляется двумя различными механизмами:

1) снижением образования первой  АФК-супероксидрадикала путем уменьшения О2 в клетке или его более быстрого использования дыхательной цепью ввиду снятия ее контроля    мН+ (Скулачев В.П., 1996);

2) функционированием  АОС.

Более широко представлен второй механизм защиты.

     АОС включает как низкомолекулярные антиоксиданты, так и антиоксидантные ферменты.Их концентрации значительно выше, чем АФК. Гидрофильный восстановленный глутатион (GSH) и аскорбиновая кислота находятся в водной фазе клетки и защищают вещества гиалоплазмы и матрикса митохондрий, а гидрофобные антиоксиданты защищают мембраны. Эти вещества перехватывают свободные радикалы, восстанавливают АФК и продукты ОМ (Кулинский В.И., 1999). Среди низкомолекулярных антиоксидантов важную роль играют пищевые вещества: витамины С и Е и каротины. Такими же свойствами обладают ураты и билирубин (Владимиров Ю.А. и др., 1991; Владимиров Ю.А. и др., 1972; Кулинский В.И., 1994; Wiseman H. et al., 1996), которые ранее считали просто ненужными и даже вредными метаболитами. Гидроксилрадикал очень реакционно-способен, и бороться с ним, по-видимому, невозможно, поэтому АОС защиты нейтрализуют и обезоруживают более ранние формы АФК-синглетный кислород, супероксидрадикал и перекись водорода. Важнейшими соединениями-антиоксидантами являются каратиноиды, аскорбиновая кислота, восстановленный глутатион, альфа-токоферол, флавоноиды и изопрен (Полесская О.Г., 2007).

     Витамин С-ключевой антиоксидант, действующий во всех клеточных  компартментах, где возможно образование  АФК. 

     Начальные и промежуточные реакции синтез аскорбата  у растений протекают в цитозоле, а заключительный этап происходит на внутренней мембране митохондрий (Полесская О.Г., 2007).

     Аскорбиновая кислота является предшественником многих соединений и кофактором многих ферментов. Обсуждается влияние аскорбата на такие процессы, как рост клеток растяжением, морфогенез, синтез этилена, гиббереллинов, антоцианов. Аскорбат является потенциальным донором атомов водорода или электронов, используемых для восстановления Н2О2, или некоторых свободнорадикальных продуктов. В ходе этих реакций аскорбиновая кислота может потерять один или два водорода с образованием МДА или ДГА:

Аскорбат          Н’+МДА’;

Аскорбат         2Н’+ДГА.

МДА и  ДГА могут восстанавливаться  до аскорбата в ходе ферментативных реакций, использующих в качестве восстановителей НАДН или НАДФН (Полесская О.Г., 2007).

     Восстановленный глутатион-небольшой пептид, состоящий из остатков трех аминокислот (гамма-Гли-Цис-Глу). Синтез глутатиона, очевидно, происходит в хлоропластах и в цитозоле, так как именно в этих компартментах были обнаружены ферменты АТФ-зависимых реакций синтеза глутатиона. Этот пептид является источником, резервуаром и транспортной формой восстановленной серы, участвует в детоксикации поглощенных растением тяжелых металлов или ксенобиотиков, а также продуктов выводимых из метаболизма. На основе глутатиона  синтезируются фитохеланины, низкомолекулярные пептиды, благодаря которым клетка нейтрализует тяжелые металлы. Восстановленный глутатион во многих реакциях является донором атомов водорода, при этом две молекулы при окислении образуют димер через дисульфидную связь:

2ГSН        ГSSГ+2Н’;

ГSSГ+НАДФН+Н’        2ГSН+НАДФ+.

                  Глутатионредуктаза

     Еще более важную роль играют антиоксидантные ферменты.Обычно выделяют три линии защиты:

1) СОД;

2) селеновая ГПО и каталаза;

3) ГПО  и ГТ, а  также недавно обнаруженная фосфолипидгидропероксид-ГПО. СОД восстанавливает супероксид:

+ + 2Н+  Н2О2 + О2 ,

каталаза - Н2О2 :

2Н2О2 2Н2О  + О2.

     ГПО - Н2О2 и органические гидропероксиды ROOH свободных жирных кислот, нуклеотидов, нуклеиновых кислот и, вероятно, белков: