ЗМІСТ

   ВСТУП…………………………………………………………………...…….....4

   ЗАГАЛЬНА  ЧАСТИНА

   Розділ  1.Обґрунтування вибору біологічного агента…………………...…......7

   Розділ  2.Характеристика біологічного агента……………………………........10

   РОЗРАХУНКОВО-ГРАФІЧНА ЧАСТИНА

   Розділ 3.Визначення показників росту при періодичному культивуванні                                                                                                                                                                                                                              мікроорганізмів..........................................................................................................15

       Завдання 3.1. Визначити швидкість росту (μ), рівень біомаси, економічний коефіцієнт, тривалість лаг-фази.........................................................15

Завдання 3.2. Визначити константу швидкості поділу (v) та тривалість генерації (ĝ)...........................................................................................................18

   Розділ 4.Поживні середовища для вирощування мікроорганізмів..................19

       Завдання 4.1. Чи правильно вказаний склад поживного середовища?....19

       Завдання  4.2. Назвати тип живлення ……………………………………..20

       Завдання 4.3. Розрахувати теоретично можливий рівень біомаси ...…...20

   Розділ  5.Енергетичний баланс окиснення глюкози...........................................22

       Завдання 5.1. . Скласти енергетичний баланс окиснення глюкози ..…...22

   ВИСНОВКИ..........................................................................................................26

   СПИСОК  ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ......................................................27 
 
 
 
 
 
 
 
 

   ВСТУП

   Біотехнологія (слово походить від грецьких bios — життя, techne — мистецтво, майстерність і logos — слово, навчання) – використання живих організмів та біологічних процесів у виробництві. За визначенням Європейської біотехнологічної федерації, біотехнологія є такою інтеграцією природничих та інженерних наук, за допомогою якої використання клітин, клітинних структур та окремих біомолекул дає можливість одержувати якісніші і дешевші продукти медичного та промислового призначення або проводити інші корисні маніпуляції. У своїй основі біотехнологія є синтезом таких наук, як мікробіологія, біохімія, молекулярна біологія, генетика, органічна, неорганічна та аналітична хімія, процеси і апарати та ін.

   На  сьогодні біотехнологія, як і інформатизація, є одним із головних науково-практичних  напрямів ХХІ ст., що визначають рівень світової цивілізації. Біотехнологічна  продукція використовується майже  у всіх галузях народного господарства: хімічному виробництві (полісахариди, біокаталіз, біодеградабельні полімери), харчовій промисловості (дріжджі, спирт, глюкозні сиропи, ферменти, амінокислоти), сільському господарстві(кормовий білок, амінокислоти, засоби захисту рослин і тварин), медицині (антибіотики, гормони, вакцини, ферменти, діагностикуми), енергетиці (біоетанол, біогаз, біодизель), екології (біоремедіація, збереження біорізноманіття) [7].

   Незважаючи  на велику різноманітність агентів, що здійснюють біотехнологічні маніпуляції, основними об’єктами  біотехнології в наш час є мікроорганізми. Останні використовуються для біосинтезу практично важливих метаболітів; одержання білкових продуктів; пробіотиків і добрив (препаратів на основі біомаси); одержання енергії (біогазу); вилущування металів із руд; трансформації речовин (синтез стероїдів, ефедрину, виробництво напівсинтетичних пеніцилінів). Велике значення має розробка способів раціонального використання біохімічної активності мікроорганізмів для підвищення родючості грунтів, видобутку корисних копалин, поповнення енергетичних ресурсів, очищення довкілля та найголовніше – для використання в харчової промисловості та фармації.

   Одне  з провідних місць у сучасній біотехнології займає виробництво  ферментних препаратів. Ферменти є високоактивними нетоксичним біокаталізаторами білкового походження, що широко розповсюджені в природі.

   Пізнання  ролі ферментів для всього живого на Землі стало основою для  становлення та розвитку технології ферментних препаратів як науки та для створення промислового виробництва найбільш широко використовуваних ферментних препаратів. Використання цих препаратів допомогло суттєво змінити, інтенсифікувати та вдосконалити багато з існуючих технологій або навіть створити принципово нові високоефективні процеси. Використання ферментних препаратів різного ступеня очистки дозволило не лише покращити показники і виходи з різних біотехнологічних процесів, але й дозволило вдосконалити виробництво кормових добавок, підвищити їх засвоєння, зробити більш ефективнішою дію синтетичних миючих засобів, покращити якість косметичних препаратів, створити цілий арсенал специфічних, чуттєвих та точних аналітичних методів, налагодити виробництво ліків та профілактичних засобів для медичної промисловості [5].

   Великим досягненням ферментів перед хімічними каталізаторами є те, що вони діють за нормального тиску, при температурі від 20 до 70⁰С, pH в діапазоні від 4 до 9 і мають  в більшості випадків виключно високу субстратну специфічність, що дозволяє в складній суміші біополімерів направлено діяти лише на певні з’єднання. Все це доводить те, що виробництво ферментних препаратів є одним з перспективних направлень в біотехнології, що буде й далі інтенсивно розвиватися і розширюватися [8].

   Згідно  прийнятої класифікації та номенклатурі на даний час ідентифіковано біля 2000 ферментів. Промисловість випускає біля 250 найменувань ферментних препаратів, причому 99% загальної суми реалізації припадає лише на 18 ферментів.

     Bacillus subtilis являється продуцентом багатьох біологічно активних речовин. Наприклад, він є важливим продуцентом ферментного препарату лізоциму Г3Х. Лізоцим – ферментний препарат, що стимулює неспецифічну реактивність організму, має бактерицидну, противозапальну та муколітичну дію. Поповнення дефіциту лізоциму являється цілком виправданим в лікуванні і профілактиці багатьох захворювань, в тому числі дисбактеріозів, тісно пов’язаних з вторинними імунодефіцитними станами.

   В харчовій промисловості зареєстрований в якості харчової добавки Е 1105 (консервант). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     ЗАГАЛЬНА ЧАСТРИНА

   Розділ 1. Обгрунтування вибору біологічного агенту

   Інтерес до мікробних ферментів і, зокрема, класу гідролаз, пояснюється недостатньою здатністю протеолітичних білків тваринного і рослинного походження задовольняти життєві потреби населення планети. Мікроорганізми є джерелом всіх типів гідролаз завдяки своїй різноманітності, простоті культивування, безпеки в роботі, здібності до генетичних перетворень. Використання ферментів має ряд переваг в порівнянні з хімічними речовинами. Протеолітичні білки мікроорганізмів високоактивні, доступні та легко біодеградуються. Останнім часом спостерігається інтенсивний розвиток біотехнологічного виробництва бактеріальних ферментів, область використання яких – промисловість, медицина, наукові дослідження. 

   Лізоцим – антибактеріальний агент, фермент  класу гідролаз, що руйнує клітинні стінки бактерій шляхом гідролізу пептидоглікану муреїну. Головним чином лізоцим  отримують з білка курячих  яєць. Також аналогічні ферменти містяться  в організмах тварин – в слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту, сльозовій рідині, грудному молоці, слині, слизу з носоглотки і т. д. У великій кількості лізоцими знаходяться в слині, чим пояснюються її антибактеріальні властивості. В грудному молоці людини концентрація лізоцима набагато вища, ніж в коров’ячому [2].

   Препарати ферментів, що виробляються промисловістю, крім основного ферменту містять  також різні баластні речовини. Назви  ферментних препаратів складаються  зі скороченої назви основного ферменту і видової назви мікроорганізму – продуцента. В назві препарату також вказується спосіб культивування і ступінь концентрації та очистки. Г3Х в назві «Лізоцим Г3Х» означає:

1. Спосіб культивування – глибинний;
2. Ступінь очистки (концентрації) – в нашому випадку 3Х – висушені препарати.

   Із  усіх відомих лізоцимів на даний  час в Латвії налагоджене виробництво  тільки курячого лізоциму з білка  курячих яєць. Він являє собою  невеликий фермент (14,5 кДа), що складається з 129 амінокислотних залишків.

   Основна відмінність яєчного лізоциму від лізоциму бактеріального походження полягає в тому, що не зважаючи на спільний об’єкт дії цих ферментів – пептидоглікан (муреїн) бактеріальної клітинної стінки – вони розщеплюють його на різні кінцеві продукти.

   У бактеріального лізоциму, на відміну від яєчного, вищий ступінь і ширший спектр літичної дії. Курячий лізоцим не діє на грампозитивні бактерії (зокрема стафілококи) на відміну від бактеріального лізоциму, який руйнує клітинні стінки коагулозонегативних видів стафілокока. Крім того, мікробні лізоцими взаємодіють з іншими групами гідролітичних ферментів, що призводить до більшого сумарного літичного ефекту. Не визиває сумніву той факт, що практичне використання мікробних ферментів набагато економніше, чим використання яєчного лізоциму [4].

   Відомо, що різке зниження рівня ендогенного  лізоциму свідчить про серйозні дефекти  систем регуляції гомеостазу, погано відображається на морфогенезі і  функціонуванні імунної системи  організму. Багато умовно патогенних бактерій можуть зменшувати концентрацію лізоциму за рахунок продуктів ангілізоцимного фактора. Тому поповнення дефіциту лізоциму являється цілком виправданим в лікуванні і профілактиці багатьох захворювань, в тому числі дисбактеріозів, тісно пов’язаних з вторинними імунодефіцитними станами.

   В основному продуцентом лізоциму являється Staphylococcus aureus. Але використання цього мікроорганізму ускладнюється через його патогенність – він є збудником цілої низки хвороб: від мінорних захворювань шкіри (прищі, фурункули, жирова гранулема, абсцеси) до таких, які загрожують життю(пневмонія, менінгіт, остеомієліт). Особливо ефективним і економічним було б створення препарату, що містить лізоцим стафілококового походження [1,2].

   Одним з підходів до рішення цієї проблеми являється клонування гена, детермінуючого синтез стафілококового лізоциму і передача його представникам нормальної мікрофлори людини.

   В наш час активно розробляються  нові види пробіотиків, що включають  в себе генно-інженерні штами  сінної палички, дріжджів, лактобацил, кишкової палички. Сконструйовані штами лактобацил і сінної палички, що мають підвищений рівень лізоцим утворювання і антагоністичну активність проти умовно патогенних бактерій, можуть бути рекомендовані в якості потенційних штамів для створення високоефективних пробіотиків.

   Вперше  як реципієнт для клонування генів стафілококового лізоциму був використаний протеазодефіцитний мутант Bacillus subtilis AJ73. Показано, що гени, які кодують синтез лізоциму стафілококів, стабільно наслідуються у клітинах  B. subtilis AJ73 в складі вектора pLFi4 і експресуються. Рівень  продукції лізоциму в клітинах бацил в 2,5 рази перевищує рівень продукції штама S. aureus 118.

   Важлива особливість В. subtilis AJ73 – здатність виділяти велику кількість синтезованих білків в культуральну рідину. В. subtilis широко розповсюджена в оточуючому середовищі. Різноманіття метаболічних  процесів в B. subtilis і відсутність патогенності стало причиною того, що представники цього виду стали широко використовуватися в різних галузях промисловості для одержання ферментів, антибіотиків та харчових добавок[3].

   В. subtilis вже протягом 30 років успішно використовується в експериментах по трансформації, і в цьому напрямі накопичений широкий досвід. На даний час В. subtilis являється найбільш вивченою грампозитивною бактерією як у генетичному, так і у фізіологічному аспекті. З урахуванням всіх вищевказаних властивостей, використання промислового штаму В. subtilis є найбільш перспективним для клонування генів лізоциму золотистого стафілококу[2].

   Сконструйовані  штами B. subtilis, які стабільно наслідують ген, що кодує синтез лізоциму стафілококів і характеризуються підвищенням рівня його продукції, можуть бути використані для виробничого отримання ферменту.  

   Розділ  2. Характеристика біологічного агенту

   Bacillus subtilis, відома також як сінна паличка чи трав’яна бацила, грампозитивна ґрунтова бактерія.  Має паличкоподібну форму і здатна утворювати захисні ендоспори. На відміну від деяких інших видів, B. subtilis історично була класифікована як облігатний аероб.

   Вперше вона була описана Крістіаном Ґоттфірдом Еренбергом в 1835 році і названа Vibrio subtilis. В 1872 році була перейменована Фердінандом Коном на Bacillus subtilis.

   Клітини B. subtilis (рис. 2.1) видовжені, вузькі (3–5x0,6 мікрон). Під час фарбування за Грамом спостерігається забарвлення клітин в фіолетовий колір. При вирощуванні B. subtilis на агаризованих середовищах спостерігається утворення колоній таких типів (рис. 2.2) : плоскі, широкі, блискучі; плоскі, тусклі, злегка маслянисті; зморщені з піднятою складчастістю. У B. subtilis нараховується від 5 до 10 типів колоній на різних агаризованих середовищах. На рідких поживних середовищах B. subtilis утворює пластівцевоподібний, комковатий осад, іноді росте у вигляді плівки. Росте на МПА, МПБ, а також на середовищах, що містять рослинні залишки, на простих синтетичних живильних середовищах для гетеротрофів.                              

   Рис. 2.1. Мікрофотографія                        Рис. 2.2. Колонії B. subtilis

   B. subtilis

   Однією  із постійних ознак у B. subtilis є утворення ендоспор при вирощуванні їх в аеробних умовах. Спороутворення розглядається як важкий процес диференціювання. Розвиток спор починається, коли популяція вегетативних клітин переходить в стаціонарну фазу. В період, перед споруляцією, в клітині знаходяться 2 нуклеотиди (0-стадія), які з’єднуючись, утворюють паличковидну структуру (1 стадія). Відбувається поява поперечної перегородки (септи) біля одного з полюсів клітини (2 стадія). В результаті формування септи від вегетативної клітини відділяється частина клітини, яка перетворюється в спору.

   Менша клітина містить цитоплазму, ДНК, мембрану. Поступово мембрана великої клітини обвиває малу і, таким чином мала перетворившись в проспору, стає як би поглинутою материнською клітиною (3 стадія). Проспора представляє собою протопласт, оточений двома шарами мембран. Далі відбувається формування нових поверхневих структур: між внутрішньою і зовнішньою мембранами закладається кортекс (4 стадія). На поверхні зовнішньої мембрани утворюється більш електроннощільний шар – оболонка спори (5 стадія). 6 стадія – формування спори. Відбувається синтез дипіколінової кислоти. 7 стадія – лізис клітини і вивільнення спори. Весь процес споруляції триває 8 годин.

   У B. subtilis  наявна капсула полісахаридної природи. Вважають, що біополімери капсули синтезуються назовні поверхні цитоплазматичної мембрани і виділяються на поверхню клітинної стінки в певних специфічних її ділянках. Також B. subtilis виділяє слизові речовини полісахаридної природи. Характерна наявність перитрихіально розміщених джгутиків.

   Досить  добре вивчені шляхи засвоєння  вуглеводів бактеріями роду Bacillus. У бацил наявний гліколітичний шлях розщеплення вуглеводів (дисиміляція глюкози) незалежно від наявності в середовищі кисню. В аеробних умовах клітини B. subtilis використовують від 60 % до 70 % глюкози за шляхом Ембдена – Мейергофа, іншу частину гексозомонофосфатним шляхом. При температурі інкубації 37˚С клітини B. subtilis при поглинанні 1 моля глюкози утворює 4 моля АТФ, а при підвищенні температури і концентрації глюкози тільки 2 моля АТФ на моль глюкози, яка споживається. B. subtilis характеризується респіраторним енергетичним метаболізмом, проте в анаеробних умовах ця культура зброджує глюкозу з утворенням 2,3-бутандіола, оцтової кислоти, етанолу, гліцерину, СО₂  [10].

   Більшість аеробних спороутвоювальних бактерій – мезофіли. Оптимум їх розвитку знаходиться в межах 30 – 40˚С. Із гарячих джерел Камчатки з температурою води 50 – 93˚С і рH 6,3 – 7,3 виділені спороутворювальні бактерії з температурним оптимумом розвитку біля 65˚С. Це В. subtilis. Можливо, що багато термофільних бактерій представляють собою варіанти мезофільних видів. Термофільні бактерії відрізняються підвищенною біохімічною активністю. Їх ферменти більш стійкі до нагрівання і денатуруючих сполук, ніж ферменти мезофілів. Серед бацил знайдені психрофільні форми, які мають здатність розмножуватись і утворювати спори при низьких температурах. Так, B. subtilis розмножуються при температурі 7˚С і нижче. Мінімальна температура розвитку психрофілів 5˚С. Але їх здатність існувати при високих температурах обмежена [7].

   Оптимум рH для розвитку B. subtilis – 7 (крайнє значення рH 8 і 2), тобто це нейтрофіли. Сінна паличка переносить концентрацію солей в середовищі від 2 до 25 %.

   Розмножується B. subtilis шляхом поділу клітини, які відбуваються після розподілу нуклеотидів. Варто відмітити, що у B. subtilis не спостерігалося повного розділення клітин навіть при повному завершенні процесу поділу.

   B. subtilis являється хемоорганогетеротрофом. В якості субстратів окислення використовують прості вуглеводи (моно- і дисахариди), деякі полісахариди (декстрин, крохмаль), органічні кислоти і спирти, а також складні високомолекулярні вуглеводи, частково пектин. Оптимальні умови вирощування – температура 30˚С, рH 6,5 – 7,0. Також встановлено,що бактерія здатна окислювати такі вуглеводні, як парафін та гексадекан [10]. Також відомо, що сінна паличка не потребує додаткових факторів росту, тобто вона є прототрофом.

   Тип цитохромної системи залежить від  умов живлення і стадії культивування. В мембранах вегетативних клітин сінної палички виявлені цитохроми типу а, с, b, аа3. Вміст цитохромоксидази значно вищий в вегетативних клітинах, ніж в клітинах, які знаходяться в стані споруляції. На середовищі з глюкозою цитохромів аа3 більше, ніж на середовищі з гідролізатом казеїна. Наявність у спорових бактерій різних механізмів переносу електронів обумовлює відмінність їх фізіологічних ознак при культивуванні в різних умовах [10].

   Клітинна  стінка жорстка. Вона складається з  пептидоглікану, полімеру цукрі та амінокислот. Пептидоглікан бактерій – муреїн. Інші складові клітинної стінки – тейхоєві, ліпотейхоєві кислоти, білки.

   Тейхоєві  кислоти являють собою гетерополімери гліцерофосфата  чи рибітфосфата, цукру. Тейхоєві кислоти Bacillus subtilis в експоненційній фазі росту містять біля 30 % всього запасу фосфору клітини. Також в цитоплазмі клітин сінної палички наявні включення. В якості запасних поживних речовин міститься глікоген, ліпіди, волютин.

   Згідно  з ІХ виданням Керівництва Бергі  з систематики бактерій (фенотипові систематика) Bacillus subtilis відносять до

   царство – Аrchaea 

   відділ  – Firmicutes

   клас  – Bacill

   ряд – Bacillalus

   порядок – Bacillales

   родина  – Bacillaceae

   рід – Bacillus

   вид – Bacillus subtilis [6]

   В останньому виданні Визначника Бергі описано 22 види роду Bacillus, які становлять 1-шу групу. Види роду Bacillus розділені в три морфологічні групи. Bacillus subtilis відноситься до першої групи, клітини якого не роздуваються при спороутворенні; спори еліпсоподібні чи циліндричні, розміщені центрально чи термінально. Види першої морфологічної групи підрозділяються на дві підгрупи: підгрупа А і підгрупа Б. Bacillus subtilis відносять до підгрупи Б. Культура характеризується відсутністю глобул в протоплазмі клітин.

     В таксономічних дослідженнях  роду Bacillus на теперішній час застосовуються методи генетичного аналізу. В клітинах аеробних спорових бактерій молярний вміст ГЦ-основ становить 32 – 65 % загальної кількості основ ДНК. За молярним вмістом ГЦ-основ в молекулі ДНК були вивчені наступні групи: 1 група; 2 група; 3 група.  Bacillus subtilis відноситься до першої групи (41,5 – 47,7 %) [10].

   Положення згідно книги «Prokaryotes» (1999 – 2001 рр., філогенетична  класифікація) рід Bacillus відносять до грампозитивних бактерій, які утворюють одну групу, яка складається з двох підгруп. Рід Bacillus входить до першої підгрупи «Clostridium»  (з низьким вмістом ГЦ у ДНК) [9]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

РОЗРАХУНКОВО  – ГРАФІЧНА ЧАСТИНА

   Розділ 3. Визначення показників росту при періодичному культивуванні                                                                                                                                                                                                                              мікроорганізмів

Завдання  3.1. Визначити:

- швидкість росту ( ) між 8 та 24 год культивування;

- рівень біомаси

- економічний коефіцієнт за умови, що початкова концентрація ацетату натрію в середовищі 20 г/л;

 - тривалість лаг-фази.

   Рис. 3.1. Крива росту бактеріальної популяції

   Швидкість експоненційного  росту – це міра швидкості росту клітин в експоненційній фазі. Виходячи з величин початкової і кінцевої біомаси Х_о та Х_t у момент часу t₀ та t :

    ,

   Де  lg e =0,43429

   Швидкість експоненційного росту (питома швидкість  росту) може також бути розрахована  за формулою:

    .

   За  умовою t = 24 год, t₀ = 8 год. За графіком (рис. 3.1) визначимо концентрацію біомаси у даний момент часу t та t₀ : X_t =3 г/л, X₀ =0,78 г/л.

   Отже,

    год ^-1.

   Рівень  біомаси (концентрація біомаси) – це різниця між максимальною (у стаціонарній фазі росту) та вихідною біомасою бактерій:

   Х= Х _макс. – Х₀.

   Згідно  з графіком (рис.3) вихідний рівень біомаси становить 0,22 г/л, а рівень біомаси у стаціонарній фазі росту – 7 г/л. Отже, концентрація біомаси становить

   7-0,22=6,78 г/л.

   Економічний коефіцієнт (Y) – відношення концентрації біомаси до кількості спожитого субстрату,

    .

   Економічний коефіцієнт може бути розрахований також  як відношення біомаси до заданого субстрату.

   Згідно  з умовою, початкова концентрація ацетату натрію 20 г/л, рівень біомаси становить 6,78 г/л, звідси економічний коефіцієнт

    , тобто 34%.

   Тривалість  лаг-фази визначають як проміжок часу між моментом t_r, в який культура досягла певної біомаси Х_r , і моментом t_t, в який вона могла б досягти такої ж біомаси, якби відразу ж після інокуляції починався експоненційний ріст.

   Тривалість  лаг-фази визначають за формулою

    , де

    .

   Рис. 3.2. Теоретична і реальна криві росту бактеріальної популяції

   За  умовою Х₀=0,22г/л; приймаємо Х_r таким, що дорівнює 2г/л. На реальній і теоретичній кривих(рис. 3.2) визначають час t_r та t_t потрібний для досягнення 2г/л біомаси: t_r =17,1год, а t_t=9,7 год. Швидкість росту розраховують за формулою для реальної кривої в інтервалі часу t_r =17,1год, та t_t=9,7 год. За реальною кривою визначають

   Х_r=2 г/л, Х_t=0,8 г/л. Отже, швидкість росту:

    год^-1.

   Знаючи  швидкість росту, можна визначити  тривалість лаг-фази:

    год.

   Отже, тривалість лаг-фази становить 9,52 год. 
 
 
 
 
 

   Завдання  3.2. Визначити константу швидкості поділу (ν) та тривалість генерації (g), якщо:

     початкова концентрація клітин  становить 10⁴ , а через 10 год – 10⁹ .

   Бактерії  розмножуються бінарним поділом, їх кількість збільшується в геометричній прогресії : 2⁰ ® 2¹ ® 2² ® 2³®….. 2ⁿ. Якщо на одиницю об’єму періодичної культури, що росте, припадає N₀ клітин, то після n поділів кількість клітин стане N₀ · 2n. Логарифмуючи, отримаємо: