Возбудитель ботулизма

Министерство  сельского хозяйства

 

 

 

 

 

Кафедра микробиологии, вирусологии и биотехнологии

 

 

 

 

Курсовая  работа

 

На  тему: «Возбудитель ботулизма»

 

 

 

Выполнил

Проверил 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание.

 

Введение  3

Общие сведения о заболевании  5

  Историческая справка  –

Возбудитель  7

  Морфология и тинкториальные  свойства  –

  Культивирование –

  Биохимические свойства  8

  Антигенная структура 9

  Устойчивость –

  Патогенность 11

  Патогенез 12

  Эпизоотологические данные 15

  Клиническая картина 16

  Патологоанатомические данные  –

  Диагностика 17

  Дифференциальная диагностика 18

  Лечение 19

  Иммунитет 20

  Биопрепараты –

  Профилактика 21

Новое о ботулизме. Токсин ботулизма в  современной медицине 22

Список  литературы 25

Введение.

 

Среди широкого многообразия болезнетворных микроорганизмов особую группу занимают патогенные анаэробы. К их числу относятся в основном клостридии, способные вызывать тяжело протекающие инфекционные или интоксикационные процессы у животных и человека.

Клостридии –  многочисленная группа почвенных анаэробных бактерий, включающая 93 вида. Однако только восемь из них истинные патогенные микроорганизмы. Они обладают рядом общих характеристик. В молодых культурах и препаратах из тканей окрашиваются грамположительно, в старых – грамотрицательно. Большинство из них перитрихи. Образуют овальную или цилиндрическую эндоспору, расположенную центрально, субтерминально или терминально. Спорообразованию предшествует увеличение поперечного измерения клеток, они раздуваются и приобретают веретенообразную (клостридиальную) форму. Растут на специальных питательных средах, в состав которых входят компоненты, обеспечивающие энергетический метаболизм в анаэробных условиях. Характерная особенность микробов данной группы – отсутствие фермента каталазы, они образуют протеазы, расщепляющие нативные и свернутые белки, ряд видов обладает сахаролитической активностью. Синтезируют высокоактивный экзотоксин, в составе которого дифференцируются гемолитический, некротический, летальный и другие компоненты.

Различные виды клостридий имеют общие антигены. Эту закономерность устанавливают не только у жгутиковых и соматических антигенов, но и у антигенов экзотоксинов.

Экологической особенностью различных представителей рода клостридий является их способность к сапрофитическому существованию, высокая устойчивость к неблагоприятным воздействиям среды, обеспечиваемая спорообразованием, и широкое их распространение практически на всех континентах («географический космополитизм»). Типичным местом их обитания и размножения служит желудочно-кишечный тракт животных.

Патогенные клостридии относятся к классу шизомицетов (Schizomycetes), порядку истинных бактерий (Eubacteriales), семейству бацилл (Bacillaceae), роду клостридий (Clostridium). Одним из важнейших возбудителей анаэробных клостридиозов является вид Cl. Botulinum, вызывающий ботулизм.

 

Общие сведения о заболевании.

 

Ботулизм (от botulus — колбаса) — тяжёлое токсикоинфекционное заболевание, характеризующееся поражением нервной системы, преимущественно продолговатого и спинного мозга, протекающее с преобладанием офтальмоплегического и бульбарного синдромов.

Развивается в результате попадания в организм пищевых продуктов, воды или аэрозолей, содержащих ботулотоксин, продуцируемый  спорообразующей палочкой Clostridium botulinum. Ботулотоксин поражает мотонейроны передних рогов спинного мозга, вследствие чего нарушается иннервация мышц, развивается прогрессирующая острая дыхательная недостаточность. Входными воротами являются слизистые оболочки дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, повреждённая кожа и лёгкие.

 

Историческая справка.

 

Предполагается, что ботулизмом люди болеют на протяжении всего периода существования  человечества. Так, византийский император  Лев VI запретил употребление в пищу кровяной колбасы из-за опасных для жизни последствий. Однако документально заболевание было зафиксировано только в 1793 году, когда в Вюртемберге заболели 13 человек, употреблявших в пищу кровяную колбасу, 6 из которых умерли. Отсюда болезнь и получила своё название — «ботулизм» (botulus — колбаса).

Позднее, на основании наблюдений в 1817—1822 годах, Ю. Кернер сделал первое клинико-эпидемиологическое описание заболевания. В изданной им монографии 1822 года он описал симптомы ботулизма (недомогание, рвота, диарея и другие), а также предположил, что небольшие дозы ботулотоксина могут быть полезны в лечении гиперкинезов. В России эта болезнь неоднократно описывалась в XIX веке под названием «ихтиизм» и связывалась с употреблением солёной и копчёной рыбы, а первое детальное исследование в России сделал Э. Ф. Зенгбуш.

В конце XIX века в Бельгии 34 музыканта, готовившихся играть на похоронах, съели сырую  ветчину домашнего приготовления. В течение суток у большинства  музыкантов начали проявляться симптомы ботулизма. В результате 3 человека погибли, а ещё 10 находились в больнице в течение недели в тяжелом состоянии. Из остатков ветчины и из селезёнки пострадавших бактериолог Эмиль ван Эрменгем выделил возбудитель и назвал его Bacillus botulinus. Также он установил, что токсин образуется не в организме больного, а в толще ветчины. Позже, в 1904 году, русский исследователь С.В. Константинов подтвердил его работы. В это же время была создана первая иммунная сыворотка для лечения ботулизма. Исследователь Алан Скотт в 1973 году провёл первые испытания ботулотоксина на животных по снижению активности гиперкинетических мышц, а затем, в 1978 году, под его руководством начались испытания возбудителя на людях, по одобренному протоколу FDA. Дальнейшее изучение показало, что в природе существует семь сероваров Cl.botulinum (A, B, C, D, E, F и G), которые отличаются по антигенной структуре экзотоксинов.

Сейчас, как и раньше, ботулизм проявляется  как в виде единичных отравлений, так и в виде групповых случаев. За 1818—1913 гг. в России было зарегистрировано 98 групповых вспышек пищевых отравлений, из-за которых пострадало 608 человек, то есть по 6,2 человека на одну вспышку. За период 1974—1982 гг. произошла 81 вспышка, на которую, в среднем, приходилось по 2,5 заболевших. В последние десятилетия распространены случаи болезни, связанные с употреблением консервов домашнего изготовления. 

Возбудитель.

 

Морфология и тинкториальные свойства.

Cl.botulinum в окрашенных препаратах имеет вид палочек с закругленными концами длиной 4-9 мкм и шириной от 0,6 до 0,8 мкм. Бактерии располагаются изолированно или парами, иногда в виде коротких цепочек. Микроб подвижен, имеет от 4 до 35 перитрихиально расположенных жгутиков; часть бактерий из молодых культур лишена жгутиков, большинство клеток из старых культур без жгутиков. Образует споры, располагающиеся субтерминально, редко центрально. Палочки со спорами имеют вид теннисных ракеток. Капсулы не имеют.

Вегетативные  клетки хорошо окрашиваются спирто-водными  растворами анилиновых красок, грамположительны в молодых культурах и на препаратах из тканей,в старых культурах – грамотрицательные.

 

 

 

 

Культивирование.

 

Возбудители ботулизма — строгие анаэробы. На поверхности плотных питательных сред растут при условии, если остаточное давление воздуха не превышает 3-10 мм ртутного столба. Хорошо растут в предварительно регенерированных жидких средах. Для культивирования применяют специальные среды: глюкозо-кровяной агар Цейсслера, печеночный агар с глюкозой, желатину с глюкозой, агар столбиком с глюкозой, среду Китта-Тароцци, бульон Хоттингера под вазелиновым маслом с кусочками мяса или печени и добавлением непосредственно перед посевом 0,5-1% глюкозы. Используют также бульоны из кислотных или триптических гидролизатов казеина, мяса и других субстратов, содержащих белки.

Оптимальная температура для роста и токсинообразования бактерий типов A, B, C и D – 35C, для типов E и F – 28-30С; споры возбудителей ботулизма типов E и F  могут прорастать, размножаться и образовывать токсин даже при 4С, развитие и токсинообразование типов А и В возможно при температуре 10-55С. Элективное значение pH 7,4-7,7.

На  среде Китта-Тароцци образует помутнение, затем появляется осадок и жидкость светлеет, культура издает запах прогорклого масла. На агаре Цейсслера вырастают прозрачные колонии – росинки величиной в несколько миллиметров с ровными или изрезанными краями и блестящей поверхностью, окруженные зоной гемолиза. Окрашены колонии в слегка коричневатый или серовато-мутный цвет, их середина вогнутая или выпуклая. Крупные колонии более плоские. В пределах одного штамма встречаются колонии нескольких типов. Одни штаммы дают полный гемолиз, другие только обесцвечивают агар.

При росте на желатине образуются круглые, блестящие, прозрачные с сероватым  оттенком колонии, иногда они окрашены в коричневатый цвет и окружены вязкой зоной разжиженной желатины. В  агаре столбиком колонии имеют  форму чечевиц или комочков ваты с уплотненным центром.

 

Биохимические свойства.

 

Cl.botulinum  при посеве на среды с сахарами ферментирует с образованием газа и кислоты: глюкозу, левулезу, мальтозу, глицерин, декстрин, салицин, адонит, инозит и не разлагает галактозу, сахарозу, дульцит, манит, арабинозу и рамнозу. Однако эти свойства непостоянны и не могут служить критерием идентификации микроба и дифференциации его типов. Бактерии типов А и В обладают высокой протеолитической активностью: они полностью переваривают кусочки печени и мышц в жидких средах; протеолитические свойства у типа F выражены слабее и минимальны у типов C, D и E.

 

 

 

 

Антигенная структура.

 

Все семь серологических типов экзотоксина  обладают иммунологической специфичностью, выявляемой в реакции нейтрализации. Специфичность токсинов А, В и Е очень высока, С и D несколько ограничена. Токсины этих двух типов не нейтрализуются антитоксинами А, В и Е, но небольшие дозы токсинов С и D перекрестно нейтрализуются большими количествами антитоксинов D и С. Известен также факт перекрестной нейтрализации специфическими антисыворотками ботулинических токсинов типов Е и F.

В пределах типов А и В в реакциях агглютинации, преципитации и связывания комплемента  по антигенам бактериальных клеток выявлены отдельные серологические группы; у типа Е обнаружено три серологические группы, у типов С, D, и F такого разделения не установлено.

Возбудители ботулизма имеют жгутиковый Н- и  соматический О-антигены, четко различающиеся  в реакции агглютинации. О-антиген  является групповым антигеном, общим для протеолитических штаммов Cl.botulinum типов А, В и Cl.sporogenes. Н-антиген типоспецифичен. Наблюдается совпадение Н-антигенов (идентичность) у бактерий, различающихся по типу экзотоксинов.

Структура антигенных детерминант ботулинических токсинов еще окончательно не изучена, но установлено, что дисульфидные группировки молекул экзотоксинов определяют их иммуногенную активность.

 

Устойчивость.

 

Вегетативные  клетки возбудителя малоустойчивы к воздействию различных факторов внешней среды. Температура 80С убивает их через 30 мин, кипячение – через 2-5 мин. Резистентность спор высока. В высушенном состоянии они могут сохранять жизнеспособность десятилетиями. К нагреванию споры более устойчивы в среде, содержащей значительное количество жира. Наличие в среде ионов железа, кальция, высокая концентрация сахарозы также повышает их устойчивость к нагреванию.

Споры клостридий ботулизма типов А, В  и F наиболее устойчивы к кипячению; наименее резистентны споры типа Е. Споры типов С и D имеют промежуточную степень терморезистентности. Так, споры типов А и В хорошо переносят кипячение при температуре 100С в течение 5 ч и погибают только через 6 ч. При нагревании до 105С споры погибают не ранее, чем через 2 ч, при 120С – через 20-30 мин. Поэтому надежным способом обезвреживания спор возбудителя ботулизма является автоклавирование не менее 30 мин при 120С. Молодые споры из 6-10-дневных культур типов А и В более устойчивы к температуре, чем споры этих типов из старых культур.

Споры хорошо переносят низкие температуры и не погибают при -190С. При -16С сохраняются до года, но часть их при этом разрушается. Поэтому замороженные субстраты, содержащие большое количество спор, могут быть ядовитыми. Споры типов А и В также обладают более высокой радиорезистентностью. Они могут переносить облучение 2,5-3 Мрад, но эта способность у различных штаммов неодинакова и зависит от состава среды, ее pH и концентрации спор. Желудочный сок и пищеварительные ферменты их не разрушают: при высеве спор в желудочный, кишечный и панкреатический сок, а также желчь они прорастают, бактерии размножаются и синтезируют токсин.

Устойчивы споры и к различным химическим бактерицидным веществам. В 5%-ном  феноле они сохраняются одни сутки, 10%-ный раствор соляной кислоты  убивает их при комнатной температуре через 1 ч, 40%-ный формалин в двойном разведении – через 24 ч, в этиловом спирте они могут сохранять жизнеспособность 2 месяца. Такой же срок они выдерживают в среде, содержащей 14% поваренной соли.

Ботулинический  токсин в жидких средах разрушается  при кипячении через 15-20 мин, в твердых субстратах – через 2 ч. Протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта (пепсин, трипсин) не разрушают токсины типов А, В, С, D, F и усиливают активность токсина типа Е, что связано с тем, что у типа Е протоксин не активируется эндогенными протеазами. В кислой среде при pH 3,5-6,8 устойчивость токсинов больше, чем в щелочной среде, при pH 7,8 они значительно снижают свои токсические свойства, pH выше 8,5 их инактивирует. В зерне токсин может сохраняться месяцами; солнечный свет и высушивание его ослабляет, но полностью не обезвреживает зерно в течение 93 дней. Зерно, обработанное 1%-ным раствором едкого натра, теряет токсические свойства через 3-6 ч.

 

Патогенность.

 

В анаэробных условиях в организме животных, субстратах растительного и животного происхождения, а также на специальных питательных средах Cl.botulinum синтезирует чрезвычайно активный экзотоксин, относящийся к группе нейротоксинов. Самый сильный токсин вырабатывает тип А. Этот токсин превосходит по своей силе все известные природные яды, 10 мг кристаллического токсина способны отравить население всего земного шара.

Каждый  из семи типов возбудителя ботулизма  обладает оригинальным токсином, имеющим  только ему присущую антигенную структуру. В составе токсина различают не менее пяти факторов: нейротоксин, гемолизин, гемолизин-гемагглютинин, липазу и протеазу. Токсическими факторами Cl.botulinum также являются ферменты патогенности и среди них протеиназы, лецитиназы и декарбоксилазы.

Наиболее  чувствительны к ботулиническому токсину лошади, у них заболевание чаще вызывается токсинами типа В, реже типов А и С. Крупный рогатый скот поражается токсинами типов С и D, овцы и козы также чувствительны к типам C и D; у коз ботулизм встречается чрезвачайно редко, но они очень чувствительны к токсину типа С. Свиньи в естественных условиях проявляют к ботулизму значительную устойчивость, однако экспериментально заболевание можно вызвать всеми типами токсина, причем животные наиболее чувствительны к типам В и F, известны случаи заболевания свиней, обусловленные токсином типа А. Собаки, кошки, волки, кайоты, другие хищники, серые крысы резистентны к заболеванию. Исключение составляют норки, которые проявляют высокую чувствительность к ботулизму и поражаются чаще всего токсином типа С.

Описан  ботулизм песцов, черно-бурых лисиц  и ондатр.

К ботулизму  восприимчивы птицы, известно более 36 видов птиц, у которых зарегистрировано это заболевание и среди них куры, индейки, утки, гуси, чайки, голуби. Ботулизм у птиц вызывается преимущественно токсинами типов С, А и В.

Восприимчив к ботулизму и человек, в качестве этиологических факторов заболевания  у человека обнаружены клостридии типов  А, В и Е.

Рыбы, амфибии и рептилии к ботулизму  практически невосприимчивы. Лабораторные животные: белые мыши, морские свинки и кролики – восприимчивы к ботулиническим токсинам всех типов.

 

Патогенез.

 

Ботулизм  является токсикоинфекцией. Токсин удается обнаружить в тонком и толстом отделах кишечника, крови, печени, желчи, моче, иногда в мозге. Особенно сильно при ботулизме поражается центральная нервная система. Первыми повреждаются мышцы, иннервируемые черепно-мозговыми нервами. В настоящее время доказано одновременное действие токсина как на периферические, так и на центральные отделы нервной системы.

Из  крови токсин проникает в органы, поражая нервные элементы. Действуя на нейроны спинальных моторных центров и продолговатого мозга, вызывает развитие паралитического синдрома; поражение же периферических моторных нервно-мышечных приборов сопровождается нарушением передачи возбуждения с нерва на мышцу. При этом полная блокада передачи импульсов не наступает.

В больших  дозах токсин угнетает тканевое дыхание  головного мозга, а также является сосудистым ядом, поражающим нервную  систему сердца и сосудов. Это  приводит к нарушениям экстра- и интракардиального иннервационного аппарата (нервной трофики), дистрофии миокарда и понижению сократительной способности мелких кровеносных сосудов.

Длительное  время считалось, что ботулинический токсин блокирует терминальные участки нервных волокон и тем самым тормозит выброс ацетилхолина в пресинаптических окончаниях. В результате нарушается проведение возбуждения в синапсах центральной нервной системы и в мионевральных аппаратах. Однако последние исследования показали, что изменение обмена ацетилхолина не играет специфической роли в механизме поражения моторных и чувствительных нейронов при ботулизме. Предполагается, что механизм действия заключается в том, что молекулы ботулинического токсина с их выраженными полярными свойствами взаимодействуют с клеточными рецепторами, в структуру которых входят сиаловые кислоты, обладающие высоким отрицательным зарядом.

Кроме специфического действия, лежащего в  основе патологического синдрома, характерного для ботулизма, токсин клостридий ботулизма ингибирует бактерицидную активность лейкоцитов.

Фагоцитоз спор Cl. Botulinum токсином не подавляется. Приблизительно через 8 ч после поглощения спор лейкоцитами они прорастают и переходят в вегетативные клетки. К этому времени бактерицидное действие лейкоцитов резко угнетается и фагоцитированные бактерии не разрушаются. Таким образом, захват спор лейкоцитами обеспечивает сохранение возбудителя в условиях макроорганизма, последующее ингибирование токсином способности переваривать вегетативные клетки создает условия для развития бактерий.

 

Ботулиновый токсин абсорбируется из ран, зараженных Cl.botulinum, или из желудочно-кишечного тракта при потреблении корма, зараженного бактериями и/или ранее образованными токсинами. Токсин также вырабатывается и всасывается в желудочно-кишечном тракте при потреблении корма, зараженного спорами.

 

Заражение ботулизмом может произойти также  аэрогенно при вдыхании пыли, содержащей токсин. Здесь в патогенезе ботулизма большую роль играет гипоксия. Развитие прогрессирующей острой дыхательной недостаточности обусловлено угнетением активности больших мотонейронов передних рогов спинного мозга, иннервирующих дыхательную мускулатуру. Гипоксическая гипоксия нарастает при обтурации бронхов аспирационными рвотными массами, слюной и пищей, что связано с парезами мышц гортани, глотки и надгортанника. Из-за гипосаливации воспаляется слизистая оболочка ротоглотки, может развиваться гнойный паротит вследствие восходящей инфекции. Гибель обычно наступает от вентиляционной дыхательной недостаточности и иногда от внезапной остановки сердца. Токсинемия вызывает угнетение ферментов пентозофосфатного шунта, ингибирование клеточных Na⁺/K⁺ насосов и обусловливает развитие гемической гипоксии.

Фармакологическое действие токсинов включает связывание Н-цепи с мембраной, поглощение токсина и расщепление L-цепью белка SNAP-25 — одного из белков семейства SNARE— на мембране синаптических пузырьков, что блокирует слияние синаптических пузырьков с пресинаптической мембраной нервного окончания.

 

Схема патогенеза ботулизма

 

 

 

 

 

Эпизоотологические данные.

 

В качестве источника возбудителя ботулизма для животных служат вода, корма, внешне доброкачественные или плесневелые, прогнившие, прелые и т. д. Очень часто источником возбудителя оказывается силос, загрязненный землей, пометом птиц или трупами грызунов. Поскольку токсин находится только в отдельных частях силосной массы, не будучи распределен в ней равномерно, заболевают не все животные. В зависимости от типа токсина зараженные корма могут быть безвредными для крупного рогатого скота и опасными для лошадей и других видов животных, и наоборот.  
          Известны случаи болезни лошадей вследствие поения водой, загрязненной экскрементами птиц, а птиц вследствие поедания развивающихся на трупах личинок мух. В последние годы зарегистрированы энзоотии ботулизма у норок в звероводческих хозяйствах. Ботулизм, как и столбняк, относится к группе антропозоонозов, т. е. к числу болезней, общих для человека и животных, причем как человек, так и животные заражаются из окружающей среды, особенно из почвы.

Ботулизм, вызванный бактериальной инфекцией  желудочно-кишечного тракта с последующим  образованием токсина, называется токсико-инфекционным ботулизмом. Из лошадей разных возрастных групп он, как правило, возникает у жеребят: здоровая микрофлора ЖКТ у взрослых животных препятствует колонизации Cl.botulinum. Бактерии, вызывающие ботулизм, заселяют участки с некротизированными тканями, например язвы желудка. Предполагается, что у взрослых лошадей отравление травой может быть связано с токсикоинфекцией Cl.botulinum типа С. Токсикоинфекционный ботулизм также возникает в результате инфицирования пуповины или ран, например кастрационных, которые обеспечивают для инфекции анаэробные условия.

 

 

Клиническая картина.

 

После инкубационного периода, продолжающегося  от нескольких часов до нескольких дней, заболевают животные, потреблявшие один и тот же содержащий токсин корм. Течение и тяжесть симптомов ботулизма определяются количеством принятого с кормом токсина, поэтому различают ее молниеносную (смерть наступает через несколько часов), острую, подострую и хроническую формы.  
           Характерный симптом ботулизма — паралич языка и жевательных мышц. Язык свисает изо рта, посиневший, опухший, иногда в язвах, распространяя отвратительный запах. Захватывание корма, жевание, глотание сильно затруднены или невозможны. Наблюдаются также потоотделение, слюнотечение, истечение из носа, окуломоторные расстройства, потеря голоса.  
           Желудочно-кишечные расстройства наблюдаются не всегда, но у лошадей могут быть колики. Пульс и дыхание учащены, чувствительность, рефлексы и память сохраняются. Температура тела остается нормальной и снижается ниже нормы незадолго до смерти, которая наступает спустя 24—48 ч при острой форме и 2—7 дней при подострой. Прево и др. (1955) описали случаи острого течения ботулизма типа С у крупного рогатого скота во Франции, напоминающие болезнь того же типа у лошадей. Авторы считают, что источником возбудителя токсико-инфекции был полностью разложившийся труп кошки.

 

 

Патологоанатомические данные.

 

Патологоанатомические изменения при ботулизме имеют неспецифический характер. Они обусловлены гиперемией, полнокровием внутренних органов, отёком головного мозга, точечным кровоизлияниям в слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта. Выражены признаки нарушения микроциркуляции в головном мозге. При этом деструктивные изменения нервных клеток умеренные. А в сосудистых стенках микроциркуляторного русла проявляются дистрофические изменения.

Отмечают  желтушность подкожной клетчатки. Паренхиматозные органы могут быть без видимых изменений. Легкие часто отечны, а в случае осложнений отмечают пневмонию или гангрену легких.

 

Диагностика.

 

Материалом  для исследования служат пробы кормов, послуживших причиной заболевания, содержимое желудка, кишечника, кровь, паренхиматозные органы свежих трупов погибших животных. Основным методом  лабораторного диагноза ботулизма  является обнаружение в исследуемых субстратах токсина; параллельно проводят выделение культуры, но это удается не всегда.

Микроскопия первичного материала в данном случае диагностического значения не имеет.

Бактериологическое  исследование. Для выделения культур исследуемый материал тщательно растирают в ступе со стерильным песком и заливают двойным количеством физиологического раствора. Посевы лучше всего делать на регенерированных жидких питательных средах с 0,5% глюкозы (Китта-Тароцци, бульон Хоттингера, мясо-казеиновый гидролизат и др.); pH должно быть в пределах 7,2-7,4. Среду заливают слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см.

Посевы  проводят в два флакона, один из них  прогревают 20 мин при 80С на водяной  бане для освобождения от неспоровых форм бактерий. Культуры выращивают при 35-37С; если имеется подозрение на типы Е и F, то при 28-30С. Типичный рост появляется на 2-3-и сутки. Культуру микроскопируют и дополнительно высевают на глюкозо-кровяной агар Цейсслера. Перед посевом культуру обязательно прогревают при 80С в течение 20 мин.

Для выделения культуры сеять можно  в высокий столбик агара с  глюкозой.

Биологическое исследование осуществляют для обнаружения ботулинических токсинов. Материал растирают и разводят, как и в предыдущем случае, затем для экстрагирования выдерживают при комнатной температуре 1-2 ч, пропускают через ватно-марлевый фильтр, можно центрифугировать при 3000 об/мин – 30 мин. Цитратную кровь и сыворотку не разводят, но исследуют сразу после взятия: токсин в них разрушается очень быстро.

Для обнаружения токсина берут четыре белые мыши по 16-18 г каждая. Двум из них исследуемый материал (0,5-0,8 мл) вводят внутрибрюшинно или внутривенно (в хвостовую вену), две другие остаются контрольными. Им инокулируют предварительно прогретый в течение 30 мин при100С экстракт.

При наличии ботулинического токсина  две первые мыши гибнут через 1-4 дня, контрольные остаются живы.

Для серологического диагноза используют реакцию нейтрализации токсинов гомологичными антитоксическими сыворотками. С этой целью берут 5 пробирок, в каждую из них вносят 2,4 мл исследуемого экстракта и добавляют по 0,6 мл антисыворотки типов А, В, С, Е (каждый тип в одну пробирку), пятая пробирка контрольная и содержит вместо сыворотки 0,6 мл физиологического раствора. Смеси выдерживают 30 мин при 37С в термостате и содержимое каждой пробирки вводят внутрибрюшинно в дозе 1 мл двум мышам. Результаты учитывают через 4-6 ч, затем через 24 ч и далее в течение четырех дней. Мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки, выживают, остальные и контрольные гибнут.