Возбудитель сибирской язвы

МОСКОВСКИЙ  ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

(МГУПП) 
 
 
 

Кафедра микробиологии и иммунологии 
 
 
 
 

Курсовая  работа

на тему: «Возбудитель сибирской язвы». 
 
 
 
 
 
 
 
 

Выполнил  – студент 2 курса

10 группы

в/с факультета

Агафонов  Александр Владимирович 

Проверила – Родионова Кира Павловна

. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Москва 2011 год.

План.

1. Определение болезни

2.Историческая справка об изучении возбудителя и болезни

3.Классификация возбудителя

4.Свойства  возбудителя

а) антигенная структура

б) морфологические свойства, ультраструктура

в) химический состав

г) культуральные свойства

д) ферментативные свойства и токсинообразование

е) изменчивость

ж) резистентность

з)  факторы патогенности

5.Лабораторная диагностика - бактериологическая, серологическая, аллергическая

6.Иммунитет и средства специфической профилактики

7.Заключение.

8.Список использованной литературы 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

1. Определение болезни

Сибирская язва (лат. — Febris carbunculosa; англ. — Anthrax) — особо опасная, острая септическая болезнь животных многих видов и человека, вызываемая Bacillus anthracis, характеризующаяся поражением кожи, кишечника, легких, лимфатических узлов и гибелью заболевших животных.

Возбудитель сибирской язвы Bacillus anthracis является этиологическим агентом острой инфекционной болезни человека и животных – сибирской язвы (антракс), характеризующейся, поражением кожи (карбункулёзная форма), кишечника (кишечная форма), лёгких (лёгочная форма) и всех внутренних органов (септическая форма). К возбудителю сибирской язвы восприимчивы все виды животных (крупный рогатый скот, овцы, козы, лошади, олени, верблюды, буйволы, свиньи) и человек. Собаки и кошки достаточно устойчивы к заражению возбудителем сибирской язвы. Из лабораторных животных к возбудителю наиболее чувствительны белые мыши, морские свинки и кролики. 
 

2.Историческая справка об изучении возбудителя и болезни

Описания  болезни с признаками сибирской  язвы известны с древних времён. Однако приоритет в установлении болезни, свойственной животным и человеку с карбункулёзными признаками, отличающиеся от чумы принадлежит русским врачам, работавшим на Алтае Абраму Эшке и Никите Ножевщикову (1758 г.), которые представили подробное научное описание болезни. В конце 18 века Паллас П.С. описал эту болезнь на Урале, вдоль реки Иртыш. Русский учёный Андреевский С.С. в 1788 году, после 3-х летней экспедиции в Челябинском округе представил русской медицинской коллегии работу «О сибирской язве», которая содержала карту распространения болезни, описание признаков у человека и животных, доказал её тождественность у человека и животных. Ему принадлежит авторство в названии болезни «Сибирская язва» по месту её изучения. В дальнейшем, до установления этиологии болезнь была описана врачами в России (Петерсон И.,1790; Гамалея М.Л., 1792;Хотовицкий С.Ф., 1831), Европе (Уден Ф.,1807;Гейрот Ф.,1807; Эллизен, 1807).

Впервые возбудитель обнаружили К.Давэн и Райе (Франция) в 1850 г. в крови погибших овец с признаками сибирской язвы в виде  нитевидных, неподвижных палочек, но их значение  оставалось невыясненным и только в 1863 г. авторы окончательно установили, что обнаруженная палочка являлась причиной заболевания овец сибирской язвой. Этот год считают официальной датой открытия бациллы сибирской язвы.

В 1876 немецкий микробиолог Роберт Кох сообщил, что обнаруженные при сибирской язве палочки являются микроорганизмом, способным размножаться делением в питательных средах и окончательно установил этиологию сибирской язвы.

В это  же время (1877 г.) Л.Пастер получил чистую культуру возбудителя сибирской язвы, доказав при этом длительное сохранение «заразного начала» в почве. Впервые он создал вакцину против сибирской язвы.

В России культуру сибиреязвенного микроба впервые получил В.К.Высокович (1882), а в 1883 году Ценковский Л.С. впервые в России создал вакцину для овец, положив тем самым начало вакцинопрофилактики животных против сибирской язвы.

Современная история исследований возбудителя  сибирской язвы, создания средств  диагностики и вакцин в России связана с такими именами ветеринарных микробиологов как Терентьев  Ф.А., Колесов С.Г., Коляков Я.Е., Бакулов И.А.

В прошлом  и в настоящее время  сибирскую  язву регистрировали  на всех континентах, в отдельных регионах болезнь  приобретала характер эпизоотий (Африка, страны Ближнего Востока, Юго-Восточной  Азии). В России, до революции 1917 года число вспышек было в среднем 35 тысяч ежегодно, а в отдельные  годы (1889-1890 г.г.) – 146-100 тысяч, соответственно. По данным Департамента ветеринарии в 1997 году в России установлен 21 неблагополучный пункт. 
 

3.Классификация возбудителя

По современной  классификации по Берджи (1986) возбудитель сибирской язвы относится к группе зоонозных болезней, свойственных преимущественно животным, но передающихся в соответственных условиях и человеку, к порядку Eubacterisales, семейству Bacillaceae, роду  Bacillus, типовому виду Bacillus anthracis.

Род Bacillus объединяет 48 видов аэробных или факультативно-аэробных бацилл, которые разделены на две группы: в первую включено 22 вида, во вторую - 26 видов. При этом, в настоящее время генетическими методами чётко доказана уникальность Bacillus anthracis и её отличие от сапрофитов - B. cereus, B. mycoides, B. thuringiensis. 
 

4.Свойства возбудителя. 

Установлено, что в подкожном отеке, образующемся на месте введения возбудителя, содержатся ядовитые вещества, вызывающие при введении в кровь быструю гибель кролика.

У бациллы  были выделены две субстанции, они  различались физическими, химическими  и биологическими свойствами. Первая из них вызывала воспаление тканей, стремилась к аноду, вступала в реакцию с фосфатом кальция, вторая имела протеиновую природу, была нетоксична, обладала иммунизирующими свойствами.

В 1953 г. был выделен сибиреязвенный экзотоксин из плазмы крови морских свинок, погибших от этой болезни, а затем  и из культуральной жидкости при выращивании Вас. anthracis на жидкой питательной среде. Установлено, что токсин не имеет отношения, как полагали раньше, к капсульному веществу, состоящему из полиглутаминовой кислоты, но он обладает близким родством с протективным антигеном.

В 1958 г. Смит определил, что y нативного сибиреязвенного токсина четко различаются отечный и летальный факторы. Один из них проходил через стеклянный фильтр и обладал свойствами протективного антигена, второй задерживался на фильтре, но легко элюировался путем обработки 0,1 М карбонатным буфером при рН 9,7. Оба фактора сами по себе не были токсичными, но их смесь проявляла выраженное токсическое действие — вызывала воспалительные реакции в коже морских свинок и гибель мышей. Установлено, что второй фактор состоит из двух антигенов.

Стэнли  и Смит (1961) показали, что, кроме указанных двух факторов (компонентов), имеется еще один, серологически отличающийся от них; он присутствовал в токсине, образующемся как в организме, так и в культуре. Эти факторы были обозначены цифрами I, II и III. Были предложены и другие обозначения: EF (эдематогенный, или воспалительный, фактор); РА (иммуногенный, протективный, антиген) и LF (летальный фактор), которые соответствовали I, II и III факторам.

Следовательно, токсическими свойствами обладает смесь  из 1 и II компонентов (увеличивается проницаемость капилляров, что обусловливает отек). Но компонент II имеет протективные свойства, вызывая иммуногенные процессы в организме. Добавления к нему компонента I значительно увеличивает его иммуногенность, но в смеси с компонентом III протективные свойства снижаются. Компонент III не обладает токсичностью, но при добавлении его к компоненту II придает смеси летальные свойства. Все три компонента токсина составляют синергическую смесь, обладающую одновременно эдематогенным и летальным действием. Это показывает, что токсин сибиреязвенных бацилл - трехкомпонентная система. Полный комплекс сибиреязвенного токсина, синтезируемого in vitro, нейтрализуется лечебным противосибиреязвенным глобулином. 
 

А. Антигенная структура

Выяснено, что у возбудителя сибирской  язвы имеется ряд антигенов: полисахаридный комплекс; капсульный полипептид; экзотоксин, в состав которого входит три компонента — воспалительный, иммуногенный (протективный антиген) и летальный. Каждый из микробных агентов (токсины, поверхностно-активные вещества, нуклеиновые кислоты и пр.) взаимодействует лишь со строго определенными молекулярными мишенями в атакуемых клетках. Они воздействуют лишь на те молекулы, с которыми у них имеется химическое родство, дополненное соответствием структур и функций, т. е. химической комплементарностью. Если подходящих мишеней нет, то микробная атака неэффективна. В этом и заключена тайна наследственного иммунитета. Изменение варианта расположения комплементарных аминокислот (единичных из множества) создает невосприимчивость.

Вирулентность сибиреязвенных бацилл определяется двумя  факторами агрессии: капсулой, представляющей полипептид d-глутаминовой кислоты; экзотоксином, состоящим из трех в отдельности нетоксичных белковых компонентов. Смесь их, как указано выше, вызывает отечность и летальность.

Имеющиеся данные свидетельствуют о значительной роли экзотоксина бациллы в проявлении многих типичных черт инфекционного процесса и формировании специфической защиты организма. Это дает основание рассматривать его как фактор, определяющий патогенез и иммунитет при сибирской язве. 
 
 
 
 
 

Б. Морфологические  свойства, ультраструктура.

Вас. anthracis — сравнительно крупная палочка (от 1,0—1,3 до 3—10 мкм), неподвижная, образует капсулы и споры, по Граму красится положительно. Вегетативные клетки могут быть с капсулой и без нее. Споры заключены в хорошо выраженный экзоспориум.

В неокрашенных препаратах, приготовленных из крови  и тканей животных, больных или погибших от сибирской язвы, бациллы имеют форму гомогенных прозрачных палочек со слегка закругленными концами. Они лежат поодиночно или соединены в короткие цепочки. Число клеток в цепочке у высоковирулентных штаммов, как правило, не превышает трех, а у низковирулентных их может быть больше.

Бациллы, выращенные на плотных или в жидких питательных средах, формируют цепочки  разной длины. В мазках культур штаммов, дававших в жидких питательных средах типичный рост в виде хлопьевидного осадка, палочки чаще располагаются длинными цепочками, а в изготовленных из культур с атипичным диффузным ростом они образуют короткие цепочки. Клетки в цепочках неодинаковой величины и напоминают цилиндры. Поверхность клеток неровная.

В окрашенных цепочках концы палочек, обращенных друг к другу, прямые, как бы обрублены, свободные же концы слегка закруглены. Бациллы, синтезирующие капсулу  при росте на средах, содержащих белки, и размножении в организме животных, формируют цепочки в виде бамбуковой трости, обрубленные концы клеток несколько вдавлены и в местах сочленения симметрично утолщены.

Бациллы имеют ядро. Ф. Я. Китаев (1922) установил, что оно участвует в делении  вегетативных клеток и его часто  обнаруживают у прорастающих спор. В 1959 г. М. Н. Мейсель и Л. В. Миролюбова определили, что ядро состоит из спиралевидных нитей, занимающих центральную часть клетки и располагающихся вдоль ее оси. Нуклеотид представлен в основном сетью фибрилл толщиной 2,5—3,0 нм, лежащих беспорядочно, но равномерно по всей его площади. В клетках 24-часовых культур длинные хроматиновые тела расположены большими комплексами, состоящими из сферических образований. Это значит, что сибиреязвенная бацилла имеет дифференцированный нуклеоид дискретного характера.

Молекула  ДНК-хромосомы двухцепочечная, замкнута в кольцо и своеобразно упакована в виде волокнистого тяжа, напоминающего перекрученный жгут соломы. Компактная форма ДНК поддерживается одноцепочечной рибонуклеиновой кислотой, в свою очередь, связанной с РНК-полимеразой и катионными белками.

Очевидно, у бациллы, способной к вегетации во внешней среде и в животном организме, очень развиты регуляторные механизмы, обеспечивающие обмен и жизнедеятельность при изменениях среды обитания. Совершенная система адаптации зависит от морфологической структуры клетки. Стенка бациллы имеет толщину 36—40 нм и состоит из трех слоев: из двух осмиофильных толщиной по 3—4 нм каждый и одного осмиофобного толщиной 30—32 нм. Но такое строение выявляют не всегда. Чаще стенка состоит из внутреннего осмиофильного, более плотного, и наружного, умеренно плотного, слоев. Наружный слой нередко переходит в фибриллярные структуры, расположенные по всей поверхности клетки. Полагают, что эти осмиофильные фибриллярные образования — остатки капсулы.

Цитоплазматическая  мембрана гладкая или несколько  извилистая. Лишь в некоторых участках клетки заметны ее три слоя, лучше они видны в лизированных бациллах.

Мембрана  имеет впячивания в цитоплазму, различающиеся по форме, величине, строению и локализации; они описаны как внутрицитоплазматические мембранные структуры. Толщина мембран в образованиях 8—10 нм. Впячивания имеют форму завитков, овалов и неровных линий, у многих бацилл они проникают в зону нуклеоида.

В цитоплазме бацилл обнаруживают четко контурированные вакуоли. Обычно они крупные, ограничены мембраной, которая служит им каркасом. С наружной стороны ее лежат рибосомы величиной 15—20 нм. Расположены они цепочками, формируя полирибосомы.

В бациллах находятся липопротеиновые гранулы, расположенные главным образом субтерминально и терминально. Выявлены также мезосомы (эквиваленты митохондрий). Они имеют форму четко контурированных, ярко светящихся желто-зеленым цветом гранул, контактирующих с цитоплазматической мембраной. Мезосомы полифункциональны. Мембранно - мезосомная система бацилл ответственна за окислительное фосфорилирование, перенос электронов, осуществление цикла ди- и трикарбоновых кислот, она вовлекается и в синтез белка. В цитоплазме после окраски выдержанным раствором метиленового синего по Леффлеру в полярных участках бациллы, а иногда и в центральной части обнаруживают гранулы велютина, окрашивающиеся метахроматически.

При окраске  Суданом черным заметны липидные гранулы, которых особенно много в период спорообразования. Их находят у спорообразующих аэробных бацилл всех видов, в том числе и у сапрофитов. Цитохимической реакцией Хочкисса на полисахариды обнаруживают мелкие гранулы гликогена. Содержатся они как в обычных, так и в спорообразующих бациллах.

Размножаются  бациллы способом деления. В клетке формируется поперечная перегородка, которая разделяет ее на две равно-половинные особи. Образование перегородки начинается с инвагинации цитоплазматической мембраны и вовлечения в этот процесс клеточной стенки. Постепенно клетка как бы перешнуровывается. Однако часто новое деление клеток начинается до завершения первого деления, что приводит к формированию стрептобацилл. Образующаяся цепочка состоит из клеток разной длины.

Бациллы выделяют экзотоксин, играющий ведущую  патогенетическую роль в развитии болезни. 
 

В. Химические состав.

В сухом  остатке вегетативных клеток содержится 6,8 % азота и 12—13,5 % минеральной золы, в сухом остатке спор — соответственно 12,14 и 41,15 %. Количество ДНК варьирует в зависимости от штамма. Наиболее высокий уровень РНК наблюдается у бактерий, находящихся в экспотенциальной фазе роста. Бациллы сибирской язвы имеют ферменты липазу, диастазу, протеазу, желатиназу, дегидразу, цитохромоксидазу, пероксидазу, каталазу, аргиназу и др.

Из тела микроба выделен соматический антиген, в состав которого входит полисахарид, содержащий в эквимолекулярных пропорциях N-ацетилглюкозамин и галактозу, а также незначительное количество О-ацетила и остатки аминокислот.

В составе  оболочки и капсулы сибиреязвенного  микроба обнаружены три антигенных комплекса:

- поверхностные  антигены капсулы, являющиеся, по-видимому, пептидами, чувствительные к действию  пепсина и частично трипсина;

- собственно  капсульные антигены, расположенные  в основном слое капсулы, содержат  вещества белково-полисахаридной  природы, чувствительные к действию трипсина, химотрипсина, гиалуронидазы и лизоцима;

- антигены  оболочки клетки, содержащие вещества  как полисахаридной, так и белковой  природы, чувствительные к действию  лизоцима и трипсина.

Антигены, обнаруживаемые с помощью флюоресцирующей сибиреязвенной сыворотки, локализованы в оболочке. Споры содержат аланинрацелеазу, нуклеозидрибозидазу, аденозиндезаминазу. У покоящихся спор эти ферменты обеспечивают слабый уровень энергетического обмена (дыхания). 
 

Г. Культуральные свойства

Bacillus anthracis размножается на обычных питательных средах при температуре 35-37⁰С. При температуре ниже 12⁰С и выше 45⁰С бациллы не растут. Оптимальная рН среды 7,2-7,6. В жидких средах (мясо-пептонный бульон, бульон Мартена, бульон Хоттингера) наблюдают на дне пробирки рост в виде хлопьев ваты, при этом бульон остается прозрачным; в твёрдых средах, на МПА (мясо-пептонный агар) образует колонии с волнистыми краями, напоминающие «голову медузы». При выращивании в средах, содержащих пенициллин, бациллы выглядят в виде шаров (феномен «жемчужного ожерелья»). В результате внесения бацилл уколом в столбик 10-12 % желатины, на 2-5 сутки наблюдают разжижение желатины (форма ёлочки, затем воронки).

Различают R-формы, S-формы и переходные формы. Вирулентные капсульные штаммы бациллы, размножаясь на твёрдых питательных средах, содержащих сыворотку, формируют колонии S-формы, авирулентные, бескапсульные –R-формы. 
 

Д. Ферментативные свойства и токсинообразование

Из многочисленной группы аэробных бацилл, обитающих  в почве, только Bacillus anthracis приобрела наиболее выраженные вирулентные свойства и способность вызывать у животных и человека болезнь со смертельным исходом. Она имеет ряд сходных морфологических и культуральных свойств с указанными непатогенными спорообразующими микробами. Особенно много идентичных признаков отмочено у Bacillus anthracis и Вас. сегeus. Имеется большой фактический материал относительно токсикогенности Вас. сегeus и её биохимической активности.

При электронно-микроскопическом исследовании у обеих бацилл (Шахбанов, 1975) выявлены как общие характерные, так и нетипичные признаки. Так, клеточная стенка у Bac. anthracis более толстая и внутри имеется фибриллярный материал, а у Вас. cereus на стенке расположены грибовидные выросты. И.Б. Павлова и Л.П. Кац (1966) выявили у Bac. anthracis более развитые мембранные структуры, что, по их мнению, вызвано большей активностью окислительно-восстановительных ферментов. Вас. cereus в отличие от Bac. anthracis быстро свертывает растворы желтка куриного яйца; имеет чрезвычайно активную лецитиназу. Она медленно редуцирует метиленовый синий, слабо восстанавливает нитраты и нитриты, вырабатывает желатиназу, а также протеазу и достаточно быстро гидролизует желатину и свернутую сыворотку.

Бацилла антракса образует сложный экзотоксин, включающий в себя три компонента (фактора): эдематогенный фактор (EF), протективный антиген (РА) и летальный фактор (LF), или соответственно факторы I, II, III. Их синтезируют капсульные и бескапсульные варианты микроба. Эдсматогенный фактор представляет собой липопротеин, вызывает местную воспалительную реакцию — отек и разрушение тканей.

Протективный антиген — носитель защитных свойств, обладает выраженным иммуногенным действием. В чистом виде нетоксичен. Летальный фактор сам по себе нетоксичен, но в смеси со II фактором (РА) вызывает гибель белых крыс, мышей и морских свинок. Протективный антиген и летальный фактор — гетерогенные в молекулярном отношении белки. Все три компонента токсина составляют синергичсскую смесь, оказывающую одновременно эдсматогенное и летальное действия, каждый из них обладает выраженной антигенной активностью и серологически активен.

Инвазивные  свойства микроба обусловлены капсульным полипептидом d-глутаминовое кислоты и экзоферментами, 
 

Е. Изменчивость

Культуры  микробов на плотных питательных  средах дают различные типы колоний, преимущественно гладкие и шероховатые. Гладкие колонии обозначили как S-форму, шероховатые - R-форму, промежуточные — О-форму.

Изучая  морфологические, культуральные и вирулентные свойства Вас. anthracis, отмечается наличие 6 вариантов, причем на МПА обнаруживается слизистая форма колонии. Эйзенберг и Шульц сообщают о шаро-, грушевидных и других морфологически измененных формах Вас. anthracis, а также о соответствующих изменениях их культуральных свойств. Например, они наблюдали образование нежной пленки на бульоне. Эти формы ученые рассматривают не как инволюционные, а как варианты данного вида микробов.

Маркоу (1912), исследуя 53 штамма Вас. anthracis, выделил 5 разновидностей, отличающихся от типичной формы и друг от друга по морфологическим и культуральным свойствам. Колонии этих разновидностей характеризовались сухим и влажным, нежным и компактным ростом на агаре, имели округлые формы и гладкие края, а также лучеобразные побеги; некоторые из них вызывали помутнение бульона.

В мазках из крови и печени выявлены наравне  с единичными типичными S-образные и крючковидноизогнутые бациллы, на концах которых отмечались булаво- или шаровидные набухания, толстые, сложно изогнутые палочки с закругленными концами. В мазках из МПБ выделялись длинные нити с морфологически измененными формами. На пластинчатом агаре наряду с типичными были получены многочисленные мутные сухие серо-белые колонии с ровными краями, которые отнесены к атипичным формам. На агаре в чашках Петри очень часто бациллы сильно изменялись, приобретая шаровидную форму.

Кроме того, Лутц описывает 7 разных вариантов по культурально-морфологическим и вирулентным свойствам и дает им обозначение R- и S-варианты, а также распределяет их на подтипы Rs (слизистые), Rt (теневидные), Rp (прозрачные), Sm (мутные) и Sp (плоские) колонии. При повторной проверке через 14 мес. получены те же варианты. Автор приходит к заключению, что у Вас. anthracis вирулентность связана с S-формой.

Принято считать, что изменение форм колоний  сибиреязвенных бацилл происходит от R- к S-форме. Следовательно, конечным вариантом будет S-форма. Но некоторые исследователи считают, что конечной является G-форма. Полагают, что наиболее устойчивы и жизнеспособны в процессе изменчивости бациллы конечных форм колоний, промежуточные же формы нежизнеспособны.

Выделенные  в хозяйстве от павших животных штаммы убивали белых мышей через 14-16-18 часов после заражения, тогда  как штаммы, полученные из почвы, вызывали смерть лишь через несколько суток. Следовательно, при длительном пребывании в почве (до 50 лет) культурно-морфологические  и вирулентные свойства возбудителя  изменились, но не нарушились антигенные.

Установлена также возможность широкого диапазона  изменчивости выделенных из почвы штаммов, вплоть до полной утраты ими вирулентных  свойств при сохранении отдельных признаков, характерных для возбудителя сибирской язвы. Из проб почв скотомогильников было выделено 20 различных по вирулентности штаммов.

В зависимости  от их свойств, культуры Bac. anthracis разделились на 5 групп: капсулолообразующие вирулентные, слабовирулентные, капсулообразующие in vivo, авирулентные, безкапсульные с остаточной вирулентностью и авирулентные.

Штаммы  первой группы имели характерные  для Bac. anthracis свойства – это типичные представители данного вида. Другая группа штаммов по культурально-морфологическим свойствам очень напоминала сапрофитных микробов, но они относятся к виду Bac. anthracis, так как сохранили вирулентность и антигенную структуру, которую определили в РП.

Случаи  выделения из почвы слабовирулентных и авирулентных штаммов послужили основанием к предположению о существовании самостоятельных видов, так для сибиреязвенных микробов могут создаваться условия, благоприятные их развитию в почве или, наоборот, препятствующие их вегетации, в результате чего возбудитель может погибнуть.

Новые случаи инфекционной болезни могут  возникнуть только при наличии трех обязательных звеньев эпизоотической цепи, связанных между собой в  определенной последовательности: источник возбудителя болезни, механизм его  передачи и восприимчивое животное.