Анықтамалар, қысқартулар мен белгілеулер

Анықтамалар, қысқартулар мен  белгілеулер 
 

Анықтама 

     Микобактерия антигендері. Жұмыс барысында Mycobacterium tuberculosis H 37RV шт., M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. kansasii микобактерияларының бүтін жасушалары, Mycobacterium tuberculosis бактериясынан өзіміз дайындалған №1 – ші липосахаридті антигенін (фенолмен өнделген), №2 – ші ультрадыбысты дезинтегратты антигендер пайдаланылды.      

     Туберкулез антигендерін алу. M.tuberculosis – тің ақуызды – полисахаридті антигендерін бөліп алу үшін О. Вестфаль және К. Ян (1967) әдісі, ультрадыбыспен әсер ету және Н.О. Шимолинаның (2000) ұсынған әдістері қолданылды.

     Алынған Mycobacterium tuberculosis антигендерінің электрофорезі V.K. Laemmli әдісімен, 7% полиакриламидті гелінде додецилсульфат натрийдің (ДСН) қатысуымен вертикальды электрофарез аппаратында жүргізілді.

     Моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушаларды алу технологиясы. M tuberculosis штаммынан бөлініп алынған ультрадыбысты дезинтегратымен иммунделген 7 – 8 апталық BALB/c тышқандарының лимфоциттері мен X63 – Ag8.6.5.3 миелома жасушаларын гибридизациялау арқылы алдық.

Қысқартулар мен белгілеулер 

     Mycobacterium tuberculosis H 37RV шт –микобактериум туберкулесистің H 37RV штамы.

     M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. kansasii микобактерияларының бүтін жасушалары.

КІРІСПЕ 

     Тақырыптың өзектілігі: Адам туберкулезі аса маңызды медициналық – әлеуметтік проблема болып табылды. Бұл ауруды ғалам тұрғындарының үштен бірі жұқтырған. Жыл сайын әлемде туберкулезге шалдыққан 9 миллиондай жаңа науқастар мен 2 миллиондай адамның өлімі тіркеледі. Дүниежүзілік Денсаулық сақтау ұйымы туберкулезді адамзат үшін ғаламдық қатер деп жариялады және бұл проблеманы шешу үшін барлық елдердің үкіметтерін жедел шаралар қолдануға шақырды.

     Қазақстан қолайсыз эпидемиологиялық жағдайдағы мемлекеттердің қатарына жатады. Қазіргі таңда республика туберкулезмен аурушаңдық және қайтыс болу деңгейі бойынша ТМД елдерінің арасында жетекші орынды алып отыр. Соңғы оңжылдықта халықтың туберкулезбен ауруы тұтастай ел бойынша 2,8 есе өсті. Жыл сайын Қазақстанда туберкулезбен 20 – 25 мың адам ауырып, үш мыңнан аса адам қайтыс болды [1].

     Қазіргі кезде республикамызда  мультирезистентті созылмалы туберкулезді  (туберкулездің дәріге төзімді микобактериялары) анықтау, диагностикалау мен емдеу барынша көкейтесті мәселе болып табылады [2].

     Туберкулездің диагностикасын жетілдіру  белгілі дәстүрлі әдістердің  сезімталдығын жоғарылатуға және  микробиологиялық тәжірибеде бұрын  қолданылмаған жаңа әдістерді  әзірлеуге бағытталған. Шетелдік және отандық зерттеулердің мәліметтері бойынша туберкулездің бактериоскопиялық және дақылдық диагностикасы әлі күнге дейін “алтын” стандарт болып жалғасып келеді [3]. Туберкулездің белсенді жағдайын сипаттайтын негізгі эпидемиологиялық көрсеткіш, науқастан анықталған бактерияны бөліп алуы болып табылады. Дифференциалды –диагностикалық мақсатта айрықша маңыздысы, себінді материалынан туберкулез микобактериясын бөліп алуға мүмкіндік беретін дақылдық зерттеу мен олардың дәрілерге төзімділігін анықтау болып табылатындығы белгілі. Үйлестірілген халықаралық стандарт ретінде Левенштейн – Йенсен қоректік ортасы қолданылады. Дегенмен, тек стандартты қоректік орталарды қолдану белсенді туберкулез қабынуының барлық жағдайында дақылдық әдіспен туберкулез микобактериясын анықтауға мүмкіндік бермейді.

     Cоған қарамастан туберкулездің иммунологиялық зерттеулер унификациясы және оны қолданудың жеке – даралығы, телемділігі мен әдістің сезімталдығы сияқты аспектілер бойынша сынама – жүйесінің сапасы мен тиімділігін жетілдіруде әлі де көп мәселелер бар, яғни туберкулездің диагностикасына арналған қолданыстағы әдістерді тұрақты түрде жетілдіріп, жаңа тест – жүйелерін әзірлеу қажет.

     Осындай өзекті мәселені шешу жолы біздің көзқарасымыз бойынша моноклоналды антиденелерді (МКА) қолдануға негізделген, яғни МКА – биотехнологияның заманауи әдістерінің бірі – гибридомды технология еөмегімен алынады. МКА негізіндегі диагностикумдар қатаң талғамдылықпен, қойылым жолдарының қарапайымдылығымен, жоғары сезімталдығымен ерекшеленеді және өндірушілік қасиеттері сақталады.

     Жұмыстың басты  мақсаты: Mycobacterium tuberculosis – ке телімді моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушалар штамдарын алу және оларды адам туберкулезін балау әдістерін жетілдіруде қолдану.

     Осы мақсатқа жету үшін келесі  міндеттер қойылды:

1. Микобактерия қоздырғыштарынан липополисахаридті және ақуызды антигендерін бөліп алып, олардың иммундыхимиялық және антигендік қасиеттерін зерттеу.
2. Туберкулез қоздырғышының антигендеріне телімді моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушалар штамдарын алу.
3. Алынған моноклоналды антиденелердің иммундыхимиялық қасиеттеріне сипаттама беру.
4. ИФТ – дың “бәсекелі” қойылымында моноклоналды антиденелерді негізінде, қосымша әдіс ретінде адам туберкулезінің балауын жетілдіру.

     Жұмыстың ғылыми  жаңалығы. Алғаш рет Mycobacterium tuberculosis – тің ақуызды антигеніне қарсы молекулалық салмағы 20,8 кДа болатын моноклоналды антиденелерді өндіретін Mus musculus – гибридті өсінді жасушаларының штамы алынды. M. tuberculosis – тің қоздырғышына телімді адам қан сарысуындағы антиденелерін ИФТ – дың “бәсекелі” қойылымында скринингтеу үшін 1Д7 гибридомасының моноклоналды антиденелерін қолдану мүмкіндігі анықталды.

     Қазақстан Республикасы Әділет  министрлігінің зияткерлік меншік  құқыңы жөніндегі Комитетінің  “Ұлттық зияткелік меншік институтынан” өнертабысқа №22178 инновациялық патенті алынды.

     Қорғауға шығарылған  негізгі қағидалар.           

1. Mycobacterium tuberculosis – тің ақуызды және липополисахаридті антигенін алу.
2. Mycobacterium tuberculosis штамының ультрадыбысты дезинтегратымен иммунделген BALB/c тышқандарының көк бауырының иммунды лимфоциттері мен x63 – Ag8.5.5.3 миелома жасушаларын будандастыру арқылы алынған гибридома штамы өндіретін моноклоналды антиденелерінің сипаттамасы.
3. Моноклоналді антиденелер негізінде адам туберкулезін балауға арналған “бәсекелі” иммунды ферменттік талдау әдісінің тиімділігі анықталды.

1. ӘДЕБИ ШОЛУ

1. Зерттеу жадығаттары мен  әдістері

     1.1.1 Зерттеу жадығаттары мен әдістері 

     Зерттеу жұмыстары 2006 – 2009 жж. РМК “Қазақстан Республикасы Ұлттық биотехнология орталығы” иммунобиотехнология және иммунохимия зертханасында “Биотехнологиялық өндірісті ғылыми – техникалық қамтамасыз ету және денсаулық сақтау саласына қажетті биопрепарараттарды әзірлеу” атты 03 тапсырма шеңберінде моноклоналды антиденелерді қолдана отыра “Адамдардың туберкулезін балау әдістерін жетілдіру” тақырыбындағы ғылыми жобасы шеңберінде орындалды.

     Микобактерия антигендері: Жұмыс барысында Mycobacterium tuberculosis H 37RV шт., M. avium, M. fortuitum, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. kansasii микобактерияларының бүтін жасушалары, Mycobacterium tuberculosis бактериясынан өзіміз дайындалған №1 – ші липосахаридті антигенін (фенолмен өнделген), №2 – ші ультрадыбысты дезинтегратты антигендер пайдаланылды.    

     Туберкулез антигендерін алу. M.tuberculosis – тің ақуызды – полисахаридті антигендерін бөліп алу үшін О. Вестфаль және К. Ян (1967) әдісі, ультрадыбыспен әсер ету және Н.О. Шимолинаның (2000) ұсынған әдістері қолданылды.

     Алынған Mycobacterium tuberculosis антигендерінің электрофорезі V.K. Laemmli әдісімен, 7% полиакриламидті гелінде додецилсульфат натрийдің (ДСН) қатысуымен вертикальды электрофарез аппаратында жүргізілді.

     Моноклоналды антиденелерді түзетін гибридті жасушаларды алу технологиясы. M tuberculosis штаммынан бөлініп алынған ультрадыбысты дезинтегратымен иммунделген 7 – 8 апталық BALB/c тышқандарының лимфоциттері мен X63 – Ag8.6.5.3 миелома жасушаларын гибридизациялау арқылы алдық. Жасушаларды будандастырушы агент ретінде полиэтиленгликольдің 45% - ты ерітіндісі қолданылды. Жасушаларды өсіру үшін құрамында 0,05 мг/мл натрий пируваты және сиыр төлінің қан сарысуының 10% - ты қосылған RPMI – 1640 қоректік ортасын пайдаландық. Пайда болған гибридті жасушаларды гипоксантин, аминоптерин, тимині бар селективті өоректік ортасында өсіргеннен кейінб J. Goding et al. (1983) әдісімен клондадық. Гибридомаларды алдын – ала прситан (2, 6, 10, 14 - тетраметилпентадекан) егілген сингенді тышқандардың құрасағында өсіру арқылы асцит сұйықтығын алып, оның моноклоналды антиденелерін қаныққант аммоний сульфаты ерітіндісінің көмегімен бөліп алдық. Гибридті штамның өндіретін моноклоналды антиденелерінің белсенділігі мен телімділігін (өсінді және асцит сұйықтығындағы) иммунды ферменттік талдаудың жанама әдісімен тексердік. Иммуноблотинг көмегімен гибридомалар қолданылған антигеннің қандай эпитопына тән антиденелерді синтездейтіндігін, ал диффузиялық преципитация реакциясында тышқандардың иммуноглобулиндеріне қарсы монотелімді қан сарысуларын қолдану арқылы моноклоналды антиденелердің класын айқындадық (O. Ouchterlony, 1958). Моноклоналды антиденелердің константтық байланысы J. Beatty et al (1987) әдісімен анықталды.

     Жұмыста қолданылған  жануарлар. Жұмысты орындау барысында келесі жануарлар түрлері қолданылды: 150 бас зертханалық ақ тышқандар мен 220 бас 6 – 8 апталық BALB/c тышқандары.

     BALB/c тышқандары Mycobacterium tuberculosis – тің УДД антигенімен иммунделіп, гибридомалық технологияға керекті антиденелерді түзетін лимфоциттердің көзі ретінде және гибридті жасушаларды in vivo жағдайында өсіріп, монколоналды антиденелерді көп мөлшерде алу үшін пайдаланылды.

     Зертханалық ақ тышқандар құрсақ қуысынан макрофагтарды бөліп алу үшін қолданылды. Бөлініп алынған перитонеальды макрофагтар гибридомалардың өсіп- өну жағдайларын жақсарту үшін планшеттердің шұңқыршықтарының беткейлеріне “қоректік қабат” ретінде отырғызылды.

     Қолданылған иммунологиялық реакциялардың көрсеткіштері Т.С. Сайдулдин (1992), Г.Ф. Лакин (1990) және Стьюдент әдістері бойынша статистикалық өңдеуден өткізілді [4].         

2. Зерттеу нәтижелері

2.1 Зерттеу нәтижелері

     2.1.1 Туберкулез антигенін алу және олардың сипаттамасы 

     Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium avium бактериалды массасынан ЛПС – ді O. Westphal бойынша сулы – фенолды әдіспен бөліп алынды. M. tuberculosis, M. bovis және M. avium дақылдарынан ЛПС шығуы сәйкесінше 2,2 – 3,5 мг құрады. Ал, M. bovis пен M. avium бактерияларында ЛПС ерітінділері сәйкесінше 97,1 және 96,6% көмірсуды құрап, қалғандары араласқан ақуыздарға 2,9 мг және 3,4 мг – ға сәйкес болды. M. tuberculosis ЛПС – де ақуыздың шығу мөлшері 2,5 мг құрады.

    Ультрадыбысты дезинтеграция (УДД) әдісімен алынған ақуызды антигеннің көрсеткіші келтірілген M. tuberculosis, M. bovis және M. Avium дақылдарынан ылғалды бактериалдық массаның шығуы 13 – 28 г аралығын құрады. Ақуызды антигеннің шығуы 1,4, 1,25, 0,65% шамасын көрсетті. Ақуыздың мөлшері Бредфорд әдісі бойынша анықталды, ақуыз мөлшері M. tuberculosis пен M. bovis – те M. avium – нан 2 есе жоғары.

     Полиакриламидті гелде натрий  додецилсульфатының қатысуымен  жүргізілген электрофорез әдісімен  M. Tuberculosis УДД ақуызды құрамын зерттеу нәтижесінде M. tuberculosis УДД құрамында 130, 116, 94, 7, 70, 66, 45, 20,8 кДа ақуызды фракциялар бар екендігін көрсетті.

     Зерттеу жұмысымыздың келесі  кезеңінде туберкулезге шалдыққан  адамның қан сарысуының иммунодиффузия  реакциясымен тексеру барысында  ЛПС антигенінің белсенділігі 1:8, ал УДД антигенінің 1:32 анықталды.

     Жұмысты орындау барысында M. Tuberculosis липополисахаридтері мен ультрадыбысты дезинтеграттың препаративті мөлшері алынды. Қанның сарысуынан туберкулезге қарсы антиденені табу үшін микобактерияларды антигендері ИФТ қолдану барысында олардың өзара айырмашылықтары анықталды, бұл препараттың антигендігі мен олар планшеттің қатты фазасында бекітілу дәрежесімен түсіндіріледі [5]. 

2.2.2 Mycobacterium  tuberculosis ультрадыбысты дезинтеграты мен   липополисахаридті антигенінің моноклоналды антиденелерді өндіретін гибридті жасушалар штамдарын алу 

     BALB/c тышқандарын иммундеудің бірінші күні құрсақ ішіне әрбір антигенді 100 мкг мөлшерде, Фрейндтің толымсыз адъювантымен (Gibco, США) тең мөлшерде араластырылып енгізілді. Иммундеудің 7,11, 12, 13 – ші күндері тышқандарға pH 7,2 – 7,4 болатын буферленген физиологиялық ерітіндіде араластыру арқылы 100 мкг антигенді енгіздік. Cоңғы иммундеуден үш күн өткен соң тышқандардың қан сарысуындағы телімді антиденелердің титрлері қатты фазалы иммунды ферментті талдау тәсілімен анықталды. Кесте 1. 

Кесте 1 – Иммунды ферменттік талдаудың жанама тәсілімен BALB/c тышқандарының  қан сарысуында түзілген антиденелер титрін зерттеу нәтижесі

     1 – ші кестеден көргеніміздей,  ұқсас антигенге қарсы Mycobacterium tuberculosis УДД – пен иммунделген тышқандардың қан сарысуындағы телімді антиденелер титрі ИФТ – да 1:25600- ге жетті. ЛПС – пен иммунделген тышқандардың қан сарысуындағы антиденелер өз антигенімен 1: 12800 титрде байланысқа түсті. Жоғарыдағы антигендерге қарсы пайда болған антиденелер арасындағы әлсіз қиылысқан реакцияның байқалуы қолданылған препараттар детерминанттарының арасындағы айтарлықтай айырмашылықтың бар екендігін дәлелдейді.

     Сонымен, біз колданған Мусоbасtеrіит tиbесиlоsis УДД антигені мен Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің липополисахаридімен ВАІВ/с тышкандарын иммундеу сызбасы, қолданылған антигенге қарсы антиденелердің жеткілікті мелшерде ілуіне мүмкіндік беріп, тәжірибедегі жануарлар организмнің иммунды жүйесін күшейтуге толығымен жарамды болды. Бұл спецификалық антнденелерді өндіретін В-лимфоциттер клондарының белсенді индукциясын көрсетеді.

     Тышкандардың әрбір антиденелер титрі тобынан максималды болған жануарлар таңдалып алынды, олардың көк бауырлары иммунды лимфоциттердің көзі ретінде колданылды. Тышкандардың лимфоциттерін Х63- Аg 8.6.5.3 линиялы миеломды жасушалармен гибридизациялауды ПЭГ-4000 қатысуымен жүргіздік.

     Гибридомалардың телімді антиденелерді  өндіретіндігін өскен ортаның аздап сарғаюы байқалганда және гибридом жасушалары ұяшық беткейі көлемінің 30%-ын алғанда тестілеуді бастайды.

     Иммунды спленоциттер мен миелома жасушаларын будандастыру нәтижелері 2-ші кестеде көрсетілген.

Кесте 2 - Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің ультрадыбысты дезингегратымен егілген ВАІВ/с тышкандардың лимфоциттері мен миелома жасушаларын будандастыру нәтижелері

     2-ші кестеден көргеніміздей, будандастырудың  нәтижесінде М. tиbеrсиlоsіs-тің ультрадыбысты дезинтеграты ақуызды антигенімен иммунделген тышқандардың спленоциттері мен миелома жасушаларының гибридизациялау кезінде жақсы көрсеткіш байкалып отыр. Гибридомалардың өсуі 384 себілген барлык ұяшықтың 90-ында байкалды, яғни жасушалардың будандасуы 23,4% кұрады. Липополисахаридті антигенімен иммунделген жануарлар лимфоциттерін колданған жағдайда бұл көрсетіш 60-қа немесе 15,6 %-ға тең болды.

     Жасуша гибридизациясының біз кол жеткізген жоғары дәрежесі ИФТ-да телімді антиденелерді түзуші гибридті клондарды анықтау жұмыстарын бастауға мүмкіндік берді. Гибридомалардың спецификалык антиденелер өндіруін тестілеу тышқандарды иммундеуге қолданылған микобактериалды антигендер көмегімен жүргізілді (3-кесте). 

Кесте 3 - Гибридомалардың өсінді сұйықтығын ИФТ-да тестілеу нәтижелері

     3-ші кесте көрсеткіштері бойынша будандастыру нәтижесінде пайда болған 90 гибридоманың 15-і ультрадыбысты дезинтегратының ақуызды антигендеріне телімді антиденелерді синтездейтіндігі байқалса, М. tuberculosis-тің ЛПС антигенімен иммунделген тышкандардың лимфоциттері мен миеломаларын будандастыру нәтижесінде пайда болған 60 гибридті жасушалардың небары 10-нан немесе 16,4%-нан ғана аталмыш антигенге телімді антиденелер анықталып отыр.

     Моноклоналды антиденелерді тұрақты  синтездейтін клондарды іріктеу мақсатында алынған гибридомалардың белсенділігі иммунды ферментті талдау көмегімен арасына 3-4 күн сала отырып бес рет тексерілді (4-кесте). 

Кесте 4 - Гибридті жасушаның  скрининг нәтижелері

    4-ші кесте мәліметтері бойынша М tиbегсиlоsіs-тін УДД антигеніне телімді антиденелерді түзетін 15 гибридомалардың барлықтары бес рет тексеру барысында да өз белсенділіктерін сактағандығы айқындалды, 15 гибридома ішінен 1G3, 1Д7 және 2С10 деп аталатын гибридті клондардың синтездейтін антиденелерінің титрі 1:64 болса, қалғандарының түзетін антиденелер титрі 1:64 бен 1:32 шамаларында болды.

     М. tuberculosis-тің ЛПС антигенге қарсы антиденелерді түзетін гибридомалардың барлығын төрт рет тестілеу нәтижесінде 1:2 мен 1:16 аралығындағы титрлерді көрсетсе, бесінші рет тексеру барысында өздерінің антиденелік белсенділіктерін тұтас жоғалтқандығы анықталып отыр.

     Сонымен, әрі қарайғы жұмыстарымызда тұракты антиденелерді түзуші клондарды М. tuberculosis УДД-мен иммунделген тышкандар лимфоциттерінен пайда болған гибридомалар арасынан ғана тандай алдық.

     1Д7, 2С10 және 103 жасушалар клондары  анағұрлым белсенді және тұрақты  гибридомалар лимитті сұйылту  әдісімен клондаудан өткізілді (5-кесте). 

Кесте 5 - Моноклоналды антиденелерді  түзетін гибридома  жасушаларын клондау  нәтижелері

     Бұл ретте бастапқы ата-аналық жасушадан гибридомдардың позитивті субклондарының шығуы 67,5%-дан 80,0%-тты құрады. Гибридомалардың алынған субклондарының ішінде микобактериалды антигендер эпитопына туыстас МКА-дің жоғары пролиферативтік белсенділігімен және өнімділігімен сипатталатын әрбір гибридомадан бір клоннан тандалып алынды. Аталмыш гибридомдардың барлық субклондарының өсінді сұйыктығының кұрамындағы моноклоналды антиденелердің титрлері 1:32 - 1:256 шамасында болды.

     Гибридома штамдарының өнімділігі 3-4 тәулік бойы өсірілген гибридомалардың өсінді сұйыктығындағы моноклоналды антиденелердің концентрациясы 125 мкг/мл-ге жетті. Гибридома штаммдарын ВАLВ/с тышқандарының кұрсақ қуысында in vivo жағдайында өсіргенде олардың өнімділігі айтарлыктай жоғары болды. Өйткені, асцитті сұйыктықтағы моноклоналды антиденелердің концентрациялары 4-6 мг/мл-ге дейін жиналды, яғни асцит сұйыктығындағы антиденелер мөлшері дақылдық ортанын супернатантымен салыстырғанда 400-1600 есеге жоғарылап отыр. Сәйкесінше асцит сұйыктығындағы антиденелер титрі де артты. Гибридома жасушаларын криоконсервациялағаннан кейінгі тіршілік ету деңгейі 65-70%-ды кұрады.

     Келесі зерттеуде асцит сұйыктығының  моноклоналды антиденелерінің белсенділігі мен телімділігі Mycobacterium туысына жататын әр түрлі бактерия ангигендерін колдану аркылы иммунды ферменттік талдаудың жанама әдісіне анықталды. (6-кесте). 

Кесте 6 - Моноклоналды антиденелердің белсенділігі мен  телімділігін иммунды ферменттік талдаудың жанама әдісіне тексеру натижесі