Кинетика ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ  РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ

 «МОГИЛЕВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ А. А. КУЛЕШОВА»

 

 

 

 

ФАКУЛЬТЕТ ЕСТЕСТВОЗНАНИЯ

КАФЕДРА ХИМИИ

 

 

 

 

 

 

Кинетика  ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой.

 

 

 

 

 

 

 

Курсовая работа

Студентки 5 курса

специальности 1-31 05 01-02

«Химия» (научно-

педагогическая деятельность)

Коржовой Марины Игоревны

 

Научный руководитель:

доцент, канд. хим. наук

Клебанов Александр  Владимирович

 

 

 

Могилев 2011

СОДЕРЖАНИЕ

 

Введение………………………………………………………………….…….3

 

1. Обзор литературы…………………………………………………………...4

 

1.1. Каталаза.……………………………..………………………….…………4

 

1.2. Механизм действия ферментов…..………………………………..….….7

 

1.3. Кинетика ферментативных реакций………………………………..…....8

 

1.4. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций……..…...11

 

 

2. Объекты исследования и методики эксперимента………………..….…..17

 

2.1. Объект исследования……………………………………………..............17

 

2.2. Методика эксперимента………………………………….……....……....17

 

    2.2.1. Определение активности фермента каталазы…………………...…17

 

    2.2.2. Принцип метода……………………………………………..…….…17

 

 

3. Экспериментальные результаты и их обсуждение…………….……..…..20

 

 

Заключение………………………………………………………………..……22

 

Список использованных источников………………………….……….……..23

 

Приложения…………………………………………………………….………24

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Ферментативный  катализ наиболее широко используется, поэтому изучение его необходимо для студентов. Ферментативный катализ  отличается исключительно высокой  эффективностью (увеличение скорости реакции в 10¹⁰ – 10¹³ раз), специфичностью и регулируемостью, т. е. изменением активности ферментов в зависимости от потребностей организма. Я исследовала фермент каталаза – это один из широко используемых ферментов. Определение активности фермента в эритроцитах человека используют в медицине для диагностики некоторых заболеваний крови.

Каталаза (от греч. Katalysis – разрушение) — фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода на воду и молекулярный кислород:

2Н₂О₂ = О₂ + 2Н₂О.

Каталаза содержится у всех животных и растений, в том числе в печени (в специальных внутриклеточных органеллах – пероксисомах), в эритроцитах млекопитающих (до 2% от сухого веса) и почти у всех аэробных микроорганизмов. Молекула каталазы из печени быка (молекулярный вес 250 тыс.) состоит из четырех идентичных субъединиц и содержит четыре иона железа. Если ионы железа удалить, то фермент полностью лишится своих каталитических свойств. Ионы железа – активные центры каталазы.

Активность  каталазы – одна из наибольших среди известных ферментов (одна молекула каталазы способна разложить за 1с 44 тыс. молекул Н₂О₂). Активность каталазы оценивают по объему выделившегося в каталитической реакции О₂ или по изменению концентрации Н₂О₂. Активность каталазы может служить индикатором состояния природной среды обитания живых организмов.

Биологическая роль каталазы заключается в защите клеточных мембран от Н₂О₂, а вместе с супероксиддисмутазой – и от супероксидного радикала. Генетически обусловленная недостаточность каталазы является одной из причин так называемой акаталазии — наследственного заболевания, клинически проявляющегося изъязвлением слизистой оболочки носа и ротовой полости, иногда резко выраженными атрофическими изменениями альвеолярных перегородок и выпадением зубов. С каталазой и пероксидазой связывают надежды на получение высокоэффективных препаратов для лечения злокачественных опухолей, так как полагают, что эти ферменты играют важную роль в росте клеток.

Цель курсовой работы – изучение кинетики ферментативной реакции разложения пероксида водорода каталазой.

 Исходя из  этого были поставлены следующие  задачи:

1) Отработка методики перманганатометрического титрования Н₂О₂;

2) Определение зависимости активности каталазы от температуры, концентрации субстрата и времени реакции;

3) Разработать и внедрить лабораторную работу.

 

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

 

1.1. Каталаза

 

Молекулярный  кислород сам по себе обычно не вступает в неконтролируемые химические реакции  внутри организма, для его активации  нужны ферментативные процессы –  главные ферменты метаболизма кислорода у млекопитающих: оксидазы и оксигеназы. Но в каталитических центрах этих ферментов кислород испытывает превращения до конечных соединений, не выделяясь в среду и не подвергая опасности органические макромолекулы клетки, повреждающими же агентами являются активные формы кислорода, образующиеся в ряде физико-химических процессов в организме. Их образование активируется при различных стрессовых ситуациях, особенно при токсическом воздействии. Главные активные формы кислорода:

• супероксидные радикалы (О₂^-),
• перекись водорода (Н₂О₂),
• гидроксильные (свободные) радикалы (* ОН, НО₂*),
• синглетные формы кислорода (¹О₂),
• ионы НО₂-.

Основные механизмы  появления активных форм кислорода  в организме связаны обычно с  нарушениями функционирования электронотранспортных цепей митохондрий или микросом, а также при изменении свойств дегидрогеназ. Особняком стоит нормальный процесс формирования активных форм кислорода фагоцитами в ходе стимуляции неспецифической защиты организма.

Гидроперекиси липидов являются весьма активными соединениями и обладают высокой биологической агрессивностью. Для протекания цепного окисления липидов в биологических мембранах совершенно необходимы переходные металлы, в частности, ионы железа. Простым и доступным методом определения продуктов перекисного окисления липидов является реакция с тиобарбитуровой кислотой.

В процессе эволюции в клетках для защиты от активных форм кислорода выработались специализированные системы: ферментативная антиоксидантная  система и неферментативная антиоксидантная система. В качестве неферментативной антиоксидантной системы могут выступать: жирорастворимые антиоксиданты (витамин Е, в-каротин, убихиноны), водорастворимые (аскорбат, рутин, глутатион). Гидрофобные антиоксиданты локализованы в биомембраннах, гидрофильные – в цитозоле клетки.

Ферментативная  антиоксидантная система включает: супероксиддисмутазу, катализирующую реакцию дисмутации О₂^- в Н₂О₂, каталазу, разлагающую Н₂О₂, глутатионпероксидазу, глутатион-S-трансферазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глутатионредуктазу. Глутатионзависимые ферменты удаляют органические перекиси.

Супероксиддисмутаза играет важную роль в защите клеток от действия супероксид-анион радикала, стабилизирует клеточные мембраны, предотвращая процессы перикисного окисления липидов. Активность супероксиддисмутазы обычно достаточна, чтобы инактивировать активные формы кислорода в месте их образования, не допуская диффузии в среде макромолекул ткани.

Дисмутация  супероксидных анион-радикалов под  действием супероксиддисмутазы в биологических тканях ведет к образованию перекиси водорода, способной легко проникать через мембраны клеток. Перекись водорода обнаруживается при фагоцитозе, при работе митохондрий и микросом. В присутствии ионов переходных металлов (например Fe²⁺) Н₂О₂ может давать высоко активный гидроксильный радикал (* ОН). Этому процессу препятствуют главные высоко активные ферменты антиоксидантной защиты организма: каталаза и глутатион-пероксидаза.

Измерение перекиси водорода в биосубстратах проводят обычно методом титрования перманганатом калия, реакцией с молибдатом аммония или прямой спектрофотометрией при длине волны равной 240 нм. Используют также пероксидазную реакцию, в ходе которой изменяется окраска индикатора, например, индигокармина, и флюориметричсекие методы.

Каталаза – один из основных ферментов разрушения активных форм кислорода и является основным первичным антиоксидантом системы защиты, который катализирует разложение токсичной перекиси водорода до молекулярного кислорода и воды:

2H₂O₂ = 2H₂O + O₂.

Разложение Н₂О₂ каталазой осуществляется в два этапа:

CAT + Н₂О₂ → CAT-Н₂О₂

CAT-Н₂О₂ + Н₂О₂ → CAT + 2Н₂О + О₂

Когда концентрация перекиси водорода становится незначительной, каталаза начинает катализировать реакцию  окисления перекисью водорода спиртов, формальдегидов и нитратов.

Открытие каталазы связано с перекисью водорода. Еще Луи Тенар, который занимался  каталитическим разложением аммиака, открыл перекись водорода в 1818 году и  заметил каталитическую активность по отношению к этому веществу животных тканей. Но только в 1907 году было установлено, что в этом повинен фермент, который и назвали каталазой. В кристаллическом виде получить ее удалось только через 30 лет из печени быка. Это один из наиболее активных ферментов, молекула которого разлагает в секунду 6 миллионов молекул перекиси водорода.

Каталаза широко распространена в тканях животных, в т.ч. человека, растений и в микроорганизмах (однако фермент полностью отсутствует  у некоторых анаэробных микроорганизмов). В клетках каталаза в основном сосредоточена в пероксисомах, в которых содержатся и ферменты, продуцирующие перекись водорода, необходимую в ходе ряда процессов жизнедеятельности организма, в частности, в процессах неспецифической иммунной защиты. Частично каталаза имеется в микросомах и в меньшей мере – в цитозоле. Максимальная концентрация каталазы обнаружена в эритроцитах.

Каталаза – это тетрамерный гем, содержащий белок, который образуется в цитозоле в виде мономеров, не содержащих гем. Мономеры переносятся в просвет пероксисом и там собираются в тетрамеры в присутствии гема. Хотя каталаза не содержит сигнальной последовательности, отрезаемой после использования, она должна иметь какой-то сигнал, направляющий ее в пероксисому. Согласно последним данным, эту роль, по крайней мере, частично играет специфическая последовательность из трех аминокислот, расположенная вблизи карбоксильного конца многих пероксисомных белков.

Каталаза – фермент класса оксиредуктаз. Она представляет собой гемопротеин, простетической группой которого является гем, содержащий ион трехвалентного железа. Молекула каталазы состоит из четырех, по-видимому, идентичных субъединиц с молекулярной массой 60 000 и имеет соответственно четыре простетические группы. Феррипротопорфириновые группы гема прочно связаны с белковой частью фермента — апоферментом и не отделяются от него при диализе.

Оптимальная величина рН для каталазы находится в интервале  значений 6,0—8,0.

Спектр поглощения нативного фермента имеет 2 главных  пика – 269 нм и 391 нм, что характерно для гемопротеинов.

Каталаза ингибируется азидом, цианидом, пероксидом водорода в высоких концентрациях и некоторыми органическими гидроперекисями. Каталаза может выступать источником образования АФК. 0,5% кислорода, образующегося в результате разложений перекиси водорода, возникает в возбужденном синглетном состоянии.

Методы определения  активности каталазы основаны на регистрации  образующегося в процессе реакции  О₂ (манометрическим или полярографическим методами) или на измерении текущей (спектрофотометрическим) или остаточной (перманганатометрическим, йодометрическим и другими титриметрическими методами) концентрации перекиси водорода.

Биологическая роль каталазы заключается в деградации перекиси водорода, образующейся в  клетках в результате действия ряда флавопротеиновых оксидаз (ксантиноксидазы, глюкозооксидазы, моноаминоксидазы и др.), и обеспечении эффективной защиты клеточных структур от разрушения под действием перекиси водорода.

Многие люди испытывают недостаточность этого  фермента, что связано с недостатком  железа и меди в крови.

Активность  каталазы в эритроцитах остается постоянной при ряде заболеваний, однако при злокачественной и других макроцитарных анемиях увеличивается, так называемый, каталазный индекс (отношение величины каталазной активности определенного объема крови к количеству эритроцитов в этом объеме), имеющий существенное диагностическое значение. При злокачественных новообразованиях отмечается уменьшение активности каталазы в печени и почках, причем существует зависимость между величиной опухоли, скоростью ее роста и степенью уменьшения активности каталазы.

 

 

 

 

1.2. Механизм действия ферментов

 

 

До установления химической природы ферментов гипотезы о механизме действия ферментов  опирались на исследования кинетики и на модельные опыты химического  гомогенного катализа. Повышение скорости химических реакций под действием ферментов объясняли:

а) активированием субстрата в результате образования  адсорбционных или молекулярных, обратимо диссоциирующих фермент-субстратных  комплексов;

б) за счет цепных механизмов реакций с участием радикалов или возбужденных молекул, активированных «ударом 2-го порядка».

Оказалось, что  цепные механизмы реакции не играют существенной роли в биологическом  катализе. После установления химической природы ферментов подтвердилось  представление, выдвинутое более 70 лет назад Арни, Михаэлисом и Ментен, о том, что при ферментативном катализе фермент соединяется (в принципе обратимо) со своим субстратом, образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс, который в конце реакции распадается с освобождением фермента и продуктов реакции. Михаэлис не только постулировал образование промежуточного фермент-субстратного комплекса, но и рассчитал влияние концентрации субстрата на скорость реакции. В процессе реакции различают несколько стадий: присоединение молекулы субстрата к ферменту, преобразование первичного промежуточного соединения в один или несколько последовательных (переходных) комплексов и протекающее в одну или несколько стадий, отделение конечных продуктов реакции от фермента.

Поскольку фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий период, долго не удавалось показать образование такого комплекса. Прямые доказательства существования фермент-субстратного комплекса были получены в лабораториях Кейлина и Чанса. В настоящее время экспериментальные и математические методы кинетики, термодинамики и статистической механики химических реакций позволяют определять для ряда ферментативных реакций кинетические и термодинамические показатели, в частности константы диссоциации промежуточных фермент-субстратных комплексов, константы скорости и равновесия их образования.

В образовании  фермент-субстратных комплексов участвуют  водородные связи, электростатические и гидрофобные взаимодействия, а  также в ряде случаев ковалентные, координационные связи. Информация о природе связей между субстратом и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами электронного парамагнитного и ядерно-магнитного резонанса (ЭПР и ЯМР), а также методами ультрафиолетовой и инфракрасной спектроскопии. Для каталитической активности фермента существенное значение имеет пространственная структура, в которой жесткие участки α-спиралей чередуются с гибкими, эластичными линейными отрезками, обеспечивающими динамические изменения белковой молекулы фермента. Этим изменениям придается большое значение в некоторых теориях ферментативного катализа. Так, согласно, гипотезе «индуцированного», или «вынужденного», контакта Кошленда, каталитически активная конфигурация молекулы фермента и соответственно активного центра может в определенных случаях возникать лишь в момент присоединения субстрата в результате его деформирующего воздействия.

В каталитическом процессе существенное значение имеют  точное соответствие между ферментом  и субстратом, а также термодинамические и каталитические преимущества подобного соответствия. Гипотеза «соответствия» предполагает существование между ферментом и субстратом не только пространственной или геометрической комплементарности, но и электростатического соответствия, обусловленного спариванием противоположно заряженных групп субстрата и активного центра фермента. Эта гипотеза не отрицает и участия всей молекулы фермента, которая, вероятнее всего, определяет более узкую субстратную специфичность. Точное соответствие обеспечивает образование эффективного комплекса между субстратом и ферментом.

Подобно другим катализаторам, ферменты, с термодинамической  точки зрения, ускоряют химические реакции за счет снижения энергии  активации. Энергией активации называется энергия, необходимая для перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при данной температуре. Другими словами, это энергия, необходимая для запуска химической реакции, без которой реакция не начинается, несмотря на ее термодинамическую вероятность. Фермент снижает энергию активации путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся реакционно-способными на более низком энергетическом уровне.

Таким образом, в механизме ферментативного  катализа ведущую роль играют промежуточные  фермент-субстратные комплексы, образование которых определяется тонкой структурой активного и эффекторного центров и уникальной структурой всей молекулы фермента, обеспечивающими высокую каталитическую активность и специфичность действия биокатализаторов.

 

 

1.3. Кинетика ферментативных реакций

 

 

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция характеризуется константой термодинамического равновесия. Она  выражает состояние химического  равновесия, достигаемого системой, и обозначается K_eq. Так, для реакции:

                                                        к₁

A+B     ↔   C+D                 (1),

                                                        к_-1

K_eq =[C]*[D] /[A]*[B]       (2)

Константа равновесия равна произведению концентраций образующихся веществ, деленному на произведение концентраций исходных веществ. Значение константы равновесия обычно находят из соотношения констант скоростей прямой (k₊₁) и обратной (k_-1) реакций, т. е. K_eq= k₊₁/k_-1. B состоянии равновесия скорость прямой реакции:

υ₊₁= k₊₁ [A]*[B]        (3)

равна скорости обратной реакции:

υ_-1= k_-1 [C]*[D]         (4)

т. е. υ₊₁ = υ_-1 соответственно, k₊₁ [A]*[B] = k_-1 [C]*[D]     (5)

или k₊₁/k_-1= [C]*[D]/[A]*[B], отсюда k₊₁/k_-1= K_eq.          (6)

Таким образом, константа равновесия равна отношению  констант скоростей прямой и обратной реакций. Величину, обратную константе  равновесия (K_eq), принято называть субстратной константой, или, в случае ферментативной реакции, константой диссоциации фермент-субстратного комплекса, и обозначать символом Ks. Так, в реакции:

E + S ↔ ES,

Ks = [E]*[S]/[ES]=k₊₁/k_-1,       (7)

т. е. Ks равна отношению произведения концентрации фермента и субстрата к концентрации фермент-субстратного комплекса или отношению констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить, что константа Ks зависит от химической природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства. Чем ниже значение Ks, тем выше сродство фермента к субстрату.

При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важную особенность этих реакций, связанную с явлением насыщения фермента субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата является почти линейной и подчиняется кинетике I порядка. Это означает, что скорость реакции S→Р прямо пропорциональна концентрации субстрата [S] и в любой момент времени (t) определяется следующим кинетическим уравнением:

υ = -d[S]/dt=k′[S],       (8)

где [S]—молярная концентрация субстрата S; -d[S]/dt—скорость убыли субстрата; k′ — константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность 1/время (мин -¹ или с-¹).

При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна  и становится постоянной и не зависящей  от концентрации субстрата [S]. В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка и целиком определяется концентрацией фермента. Различают, кроме того, реакции 2-го порядка, скорость которых пропорциональна произведению концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропорциональности говорят о реакциях смешанного порядка.

Изучая явление насыщения, Михаэлис и Ментен разработали общую  теорию ферментативной кинетики. Они  исходили из предположения, что ферментативный процесс осуществляется в виде следующей химической реакции:

^{k+1        k+2}

Е+S↔ЕS→Е+Р,

^k-1

т.е. фермент  вступает во взаимодействие с субстратом с образованием промежуточного комплекса  ЕS, который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Математическая обработка на основе закона действующих масс дала возможность вывести уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса—Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:

υ =V*[S]/Ks+[S],          (9)

где υ — наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата [S]; Ks — константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л; V — максимальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.

Из уравнения  Михаэлиса—Ментен следует, что при высокой концентраций субстрата и низком значении Ks скорость реакции является максимальной, т. е. υ =V; при низкой концентрации субстрата напротив, скорость реакции оказывается пропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция 1-го порядка).

Однако следует, указать, что уравнение Михаэлиса—Ментен в его классическом виде не учитывает  влияния на скорость ферментативного  процесса продуктов реакции, например в реакции:

^{k+1          k+2}

Е+S↔ЕS  ↔ Е+Р,

^{k-1           k-2}

и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки усовершенствования его. Так было предложено уравнение Бриггса —Холдейна:

υ =V*[S]/Kм+[S],       (10)

где Kм представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим уравнением:

Kм=(k_-1+k₊₂)/k₊₁ или Kм=(k_-1/k₊₁)+(k₊₂/k₊₁)       (11)

В числителе  представлены константы скоростей  распада комплекса ЕS в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в  сторону конечных продуктов реакции Е и Р). Отношение k_-1/k₊₁ представляет собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса Ks. Если

k_-1/k₊₁=Ks,          (12)

то Kм=Ks +(k₊₂/k₊₁).         (13)

Отсюда вытекает важное следствие, что константа  Михаэлиса всегда больше, чем константа диссоциации фермент-субстратного комплекса Ks на величину k₊₂/k₊₁.

Для определения численного значения Kм обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции и составляет половину от V; т.е. если  υ=1/2V, то, подставляя значение υ в уравнение Бриггса— Холдейна, получаем:

V/2=V*[S]/Kм+[S];           (14)

разделив обе  части уравнения на V, имеем:

1/2 = [S]/Kм+[S]         (15)

или Kм+[S]= 2[S], откуда

Kм=[S]            (16)

Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции составляет половину от максимальной. Определение величины Kм имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Экспериментальные значения Kм для большинства ферментативных реакций с участием одного субстрата лежат обычно в пределах 10ˉ²—10ˉ⁵М.

Характерным свойством  ферментов является их способность  катализировать определенные химические реакции. При изучении каталитической активности ферментов необходимо основываться на количественной оценке скоростей  катализируемых реакций. Изучение влияния  различных факторов на скорость данной реакции дает возможность делать выводы о механизме действия фермента. В идеальном случае данные кинетических исследований следует сопоставлять с данными, полученными при изучении химии и структуры фермента, чтобы получить более глубокую характеристику изучаемого процесса. Однако это возможно только тогда, когда соответствующий фермент достаточно хорошо очищен. Изучение кинетики действия ферментов важно не только с теоретической, но также и с чисто практической стороны. При выборе единицы активности фермента необходимо, например, знать наилучшие условия его действия, а также то, как влияют на его активность различные факторы. Подобное предварительное изучение кинетики действия обычно необходимо и для успешного осуществления очистки фермента, так как этот процесс должен количественно контролироваться путем систематических определений активности ферментного препарата на разных стадиях очистки.

Хорошо известно, что биологические системы, особенно живые клетки, более чувствительны к изменениям температуры, рН и ряда других факторов, чем большинство химических процессов в небиологических системах, и это является в основном отражением свойств ферментов, от действия которых зависит функционирование биологических систем. Поэтому знание кинетики действия ферментов помогает при анализе многих биологических явлений.

Без данных о  кинетике действия фермента невозможно решить вопрос о химическом механизме  его функционирования или о том, как он действует в клетке.

 

 

1.4. Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций

 

К числу главных  факторов, определяющих начальную скорость ферментативной реакции, относятся: концентрация фермента, концентрация субстрата, рH, температура присутствие активаторов или ингибиторов, ионная сила.