Кормовые добавки биотехнологического генеза

ВУЗ ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова»

Кафедра микробиологии, вирусологии и биотехнологии

Задание по подготовке курсовой работы:

 
Студенту Степановой О.И.                    Зав. кафедрой: ___________                                                                            

                            (Ф.И.О.)                                                               (подпись)

Тема работы: Кормовые добавки            Руководитель:__________                      

биотехнологического генеза                                                           (подпись)

               (наименование темы)

утверждена кафедрой: _________________________________

Дата выдачи задания:         Задание принял к исполнению:

______________________                     Студент _____________________

                                                                                            (подпись)

Исходные данные к работе:                 13

                                                          (шифр, номер варианта)

Перечень вопросов, подлежащих разработке:

1. Брожение, виды, значение. 2. Амплификация и экспрессия генов. 3. Буферные системы, свойства, типы. 4. Способы повышения эффективности антибиотических препаратов. 5. Вопросы, задачи, упражнения (4 и 17).

Рекомендуемая литература:

1. Горбатова, К.К. Биохимия молока и молочных продуктов / К.К. Горбатова. - 3-е изд., перераб и доп. - СПб. : ГИОРД, 2004. 2. Блинов, Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Блинов. - СПб. : Издательская фирма «Наука» 1995. 3. Шевелуха, В.С. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевс-луха и др. - М. : ВШ, 2003. 4. Глик, Б. Молекулярная биотехнология Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак ; пер. с англ. Н.В. Баскаковой и др.; под ред. Н.К. Янковского. - М. : Мир, 2002.

Срок сдачи законченной работы:    __________________________

                                                                 (заполняется проверяющим)

Содержание 

Введение……………………………………………………………………...4

Раздел 1. Принципы селекции микроорганизмов: гибридизация…....6

Раздел 2. Иммобилизация ферментов путем поперечных сшивок….16

Раздел 3. Как определить и от чего зависит плотность молока?.........25

Раздел 4. Кормовые добавки биотехнологического  генеза…………...32

Раздел 5. Задачи…………………………………………………………....44

Раздел 6. Выводы……………………………..............................................50

Заключение………………………………………………………………....51

Список источников литературы………………………………………...52

Введение

Биотехнология – дисциплина, изучающая возможности использования живых организмов, их систем или продуктов их жизнедеятельности для решения технологических задач, а также возможности создания живых организмов с необходимыми свойствами методом генной инженерии.

К первоочередным задачам современной  биотехнологии относятся создание и широкое освоение:

1. новых биологически активных веществ и лекарственных препаратов для медицины (интерферонов, инсулина, гормонов роста, антител);
2. микробиологических средств защиты растений от болезней и вредите­

 лей, бактериальных удобрений  и регуляторов роста растений, новых высокопродуктивных и устойчивых  к неблагоприятным факторам внешней  среды гибридов сельскохозяйственных  растений, полученных методами генетической  и клеточной инженерии;

3. ценных кормовых добавок и биологически активных веществ (кормового белка, аминокислот, ферментов, витаминов, кормовых антибиотиков) для повышения продуктивности животноводства;
4. новых технологий получения хозяйственно-ценных продуктов для использования в пищевой, химической, микробиологической и других отраслях промышленности;
5. технологий глубокой и эффективной переработки сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов, использования сточных вод и газовоздушных выбросов для получения биогаза и высококачественных удобрений.

Целью данной курсовой работы является изучение кормовых добавок, производимых биотехнологическими методами.

Задачи:

1. освоение рынка кормовых добавок в России и зарубежом;
2. выявление современных проблем животноводства;
3. изучение кормовых добавок, производимых методами биотехнологии и применяемых в животноводстве;
4. поиск подробной информации по кормовым добавкам, производимым компанией «Биоэнергия»;

Раздел 1. Принципы  селекции микроорганизмов: гибридизация

Микроорганизмы (бактерии, микроскопические грибы, простейшие и  др.) играют исключительно важную роль в биосфере и хозяйственной деятельности человека. В природе известно более  чем 100 тыс. видов  микроорганизмов.

Качественный скачок в  их использовании произошел в  последние десятилетия, когда были установлены многие генетические механизмы  регуляции биохимических процессов  в клетках микроорганизмов.

Многие из них продуцируют  десятки видов органических веществ  – аминокислот, белков, антибиотиков, витаминов, липидов, нуклеиновых кислот, ферментов, пигментов, сахаров, которые широко используются в разных областях промышленности и медицины[1]. Такие отрасли пищевой промышленности, как хлебопечение, производство спирта, молочных продуктов, виноделие и многие другие, основаны на деятельности микроорганизмов.

Селекция микроорганизмов (в отличие от селекции растений и животных) имеет ряд особенностей:

1) у селекционера имеется  неограниченное количество материала  для работы: за считанные дни  в чашках Петри или пробирках  на питательных средах можно  вырастить миллиарды клеток;

2) более эффективное  использование мутационного процесса, поскольку геном микроорганизмов  гаплоидный, что позволяет выявить  любые мутации уже в первом  поколении; 

3) простота генетической  организации бактерий: значительно  меньшее количество генов, их  генетическая регуляция более  простая, взаимодействия генов  просты или отсутствуют.

Эти особенности накладывают  свой отпечаток на выбор методов  селекции микроорганизмов, которые  во многом существенно отличаются от методов селекции растений и животных.

Методы современной селекции –  это генетическое конструирование, т. е. совокупность приемов, с помощью которых сознательно изменяют генетическую программу микроорганизмов.

К ним относят:

1. конъюгацию – один  из способов трансформации, при котором в результате физического контакта (через секс-пили) происходит передача генетического материала от одной бактерии (донора) другой (реципиенту), относящихся к одному, редко к разным видам. (Установлена у представителей семейств  энтеробактерий и псевдомонад).
2. трансдукцию – перенос генетического материала (часть молекулы ДНК с содержащимися в ней генами) из одной клетки в другую с помощью вируса, что приводит к изменению наследственных свойств клеток–реципиентов.
3. трансформацию – один  из способов рекомбинации, состоящий в передаче через окружающую среду фрагмента генома лизированной бактерии-донора бактерии-реципиенту.
4. и другие генетические процессы (например, индуцирование мутаций).

Важным подходом в селекционной работе с микроорганизмами является получение рекомбинантов путем  гибридизации. Еще 15 лет назад был разработан метод гибридизации соматических клеток для проведения генетических исследований на клеточных культурах. На его основе была создана методика генетической рекомбинации путем искусственно вызываемого слияния протопластов; ее уже удалось с успехом применить на материале грибов и растений[2].  Лишь недавно этот метод генетической рекомбинации был испытан и на бактериях: получали протопласты и затем индуцировали их слияние путем обработки полиэтиленгликолем. Из слившихся протопластов в определенных экспериментальных условиях регенерировали морфологически полноценные клетки, из которых получались стабильные рекомбинанты, обладавшие некоторыми признаками обоих родительских штаммов[1].

Слияние протопластов позволяет  объединить генетические материалы  таких микроорганизмов, которые  в естественных условиях не скрещиваются.

В опытах по гибридизации обычно берут генетически маркированные штаммы микроорганизмов – чаще всего ауксотрофные мутанты и мутанты, устойчивые к ингибиторам роста. Это позволяет выявлять колонии, совмещающие признаки обоих родителей .

Если исходные клетки были гаплоидными (т. е. содержали только один набор хромосом), то в результате последующего слияния ядер (кариогамии) появится диплоидная клетка (зигота), несущая два набора хромосом в одном ядре (рис. 1). У некоторых микроорганизмов, например у Nеиrosроrа сrassа, диплоидное ядро сразу же подвергается мейозу. Вегетативные диплоиды у этого организма неизвестны. В ходе мейоза каждая из хромосом продольно расщепляется и какое-то время состоит из двух сестринских хроматид. Гомологичные хромосомы образуют пары и обмениваются частями своих хроматид в результате кроссинговера. Затем формируются гаплоидные половые споры, каждая из которых может содержать новый набор генов, которыми различались родительские клетки, в результате рекомбинации генов одной и той же хромосомы, а также разных хромосом при перераспределении хромосомных пар (рис. 1).

У аспергилл, дрожжей-шизосахаромицетов, водоросли хламидомонады диплоидное ядро иногда начинает делиться и образуются диплоидные вегетативные клетки. С другой стороны, у дрожжей-сахаромицетов вегетативные клетки обычно диплоидны, а мейоз и образование гаплоидных половых спор происходит лишь в специальных условиях.

Если после слияния  клеток ядра не сливаются, то образуются формы со смешанной цитоплазмой и ядрами разного происхождения – гетерокарионы. Более или менее устойчиво сохраняющиеся гетерокарионы свойственны мицелиальным грибам, например пенициллам. Гетерокарионы и гетерозиготные диплоиды, образующиеся при слиянии генетически разнородных клеток, имеют ряд общих свойств. И в том, и в другом случае в цитоплазму поступают продукты активности каждого из двух гомологичных генов, происходящих от обеих родительских клеток. В связи с этим наблюдается явление доминирования, т. е. проявление или преобладание признака одного из родителей. Например, способность к синтезу какого-либо метаболита обычно доминирует над рецессивным признаком – неспособностью к его образованию. Доминантность и рецессивность определяются свойствами аллелей, т. е. гомологичных генов, находящихся в альтернативных состояния[4].

При размножении полученного  в результате гибридизации гетерозиготного  диплоида или гетерокариона происходит расщепление – появление в потомстве форм, обнаруживающих не только доминантные, но и рецессивные признаки родителей.

Рис. 1. Схема рекомбинации у эукариот (по Д. Хопвуду, 1984):

I – гаплоидные клетки;

II – слияние клеток;

III – слияние ядер, (содержащих две хромосомы), образование диплоидной клетки, мейоз;

 IV — формирование гаплоидных клеток с новым набором хромосом

Для получения протопластов (рис.2) у микроорганизмов (этот процесс называют протопластированием) используют несколько методов. Одни из них основаны на подавлении синтеза клеточной стенки структурными аналогами ее компонентов и антибиотиками. С этой целью используют пенициллин и фосфомицин или высокие концентрации аминокислот глицина, метионина, треонина и др. Указанные соединения так или иначе нарушают синтез пептидогликана – основного компонента оболочки бактерий.

У дрожжей для получения  протопластов применяют 2-дезоксиглюкозу – аналог глюкозы, препятствующий образованию у них клеточной стенки. В настоящее время эти методы в основном утратили самостоятельное значение.

Вторая группа методов предполагает ферментативный лизис клеточной стенки. С этой целью у бактерий широко используют фермент лизоцим, который растворяет пептидогликан. В некоторых случаях эффективность образования бактериальных протопластов повышается, если дополнительно обрабатывать клетки протеолитическими ферментами и липазами. У грамотрицательных бактерий обработку лизоцимом ведут в присутствии этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) и только в этом случае получают удовлетворительные результаты (2). Иногда используют более специфические ферментные препараты: лизостафин – для получения протопластов у стафилококков, мутанолизин – для получения протопластов у молочнокислых бактерий.

Для протопластирования мицелиальных грибов и дрожжей применяют литические ферменты из актиномицетов или грибов базидиомицетов[1]. Клеточная стенка дрожжей эффективно растворяется также пищеварительным соком виноградной улитки Нeliх ротаtiа («геликаза»), который содержит несколько десятков различных ферментов. Кроме того, используют ферментные смеси, состоящие из геликазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, хитиназы, пектиназы и других ферментов.

Нередко для получения протопластов клетки выращивают сначала в присутствии ингибиторов синтеза клеточной стенки, а затем обрабатывают их литическими ферментами. Например, протопластирование коринебактерий с помощью лизоцима осуществляют после культивирования их в среде с низкими (субингибирующими) концентрациями пенициллина.

 Протопласты, имеющие только  эластичную цитоплазматическую мембрану, сохраняют целостность и жизнеспособность в гипертонических средах, где они приобретают сферическую форму. В гипотонических растворах, например в дистиллированной воде, происходит лизис протопластов, и это является одним из показателей их образования. Поэтому получение протопластов и все манипуляции с ними проводят в присутствии осмотических стабилизаторов, которые добавляют в концентрациях (0,2 – 0,5 моль), компенсирующих внутриклеточное давление. В качестве осмотических стабилизаторов используют минеральные соли (КС1, NaС1, NH₄Сl, NaNО₃), соли органических кислот (сукцинат натрия), многоатомные спирты (маннитол, сорбитол), углеводы (сахароза, рамноза, ксилоза и др.). Природа и концентрация осмотического стабилизатора могут влиять как на эффективность образования протопластов, так и на их стабильность. Например, протопластирование коринебактерий, проводят в среде, содержащей 0,41 М сахарозы. При более низких и более высоких концентрациях выход протопластов и их жизнеспособность снижаются[2]. Кроме того, образование и сохранение протопластов зависят от температуры и рН среды, концентрации литического фермента и времени инкубирования с ним, возраста (фазы роста) протопластируемой культуры. Так, очень хорошо протопластируются старые культуры пенициллов и плохо – старые бактериальные культуры.

Использование протопластов в генетических экспериментах стало возможным после того, как было обнаружено, что эффективным индуктором их слияния является полиэтиленгликоль (ПЭГ) – хорошо растворимый в воде полимер. Поверхность клеток и протопластов заряжена отрицательно и окружена водным слоем. Эти факторы препятствуют контакту и слиянию мембран. Действие ПЭГ сводится к тому, что он, по-видимому, снижает поверхностный заряд протопластов и отбирает у них воду. Тем самым создаются условия для тесного контакта и слипания мембран. В местах слипания происходит разрыв мембран и содержимое двух соседних протопластов объединяется. Образующиеся структуры сохраняют способность к восстановлению клеточной стенки. В результате появляются гибридные клетки.

клетка       протопласт       клетка

Рис. 2. Схема слияния протопластов

Следует указать на ряд особенностей метода слияния протопластов как способа генетического обмена. В отличие от конъюгации, трансдукиии и трансформации у бактерий, при которых в реципиентную клетку попадает лишь часть наследственного материала донора, при слиянии протопластов объединяются и взаимодействуют целые геномы, а также все компоненты цитоплазм родительских клеток. Кроме того, в акте слияния может участвовать более двух протопластов разных штаммов и в результате сразу появляются рекомбинанты, наследующие признаки трех (и более) родителей.

К настоящему времени способы получения  и слияния протопластов описаны для многих десятков видов бактерий, актиномицетов, грибов и дрожжей. Как уже отмечалось, с помощью этого метода можно получать гибридные формы у тех видов микроорганизмов, у которых не обнаружены природные механизмы обмена наследственной информацией, но которые имеют важное значение для микробиологической промышленности.

Таким образом, универсальность, относительная простота и доступность метода слияния протопластов делают особенно полезным его применение в селекции промышленных микроорганизмов. Метод слияния протопластов позволяет объединять в одном геноме мутации, положительно влияющие на продуктивность и полученные в разных селекционных линиях, в том числе такие, которые трудно или даже невозможно последовательно индуцировать в одной и той же клетке, а также избавляться от вредных мутаций, снижающих жизнеспособность штаммов-продуцентов. Во многих отношениях этот метод является более эффективным, чем все другие способы обмена наследственной информацией[4]. Так, при слиянии протопластов актиномииетов частота образования рекомбинантов на 3–4 порядка превосходит вероятность их появления при конъюгации и иногда приближается к 100%. В этих условиях не требуются специальных приемов для контрселекции родительских штаммов. Кроме того, для применения протопластов практически нет никаких ограничений, в то время как конъюгация наблюдается только у отдельных видов. Все это делает метод слияния протопластов очень перспективным для селекционной работы с актиномицетами, которые являются продуцентами многих важных антибиотиков. Появились сообщения о том, что с помощью этого метода сконструированы эффективные штаммы-продуценты, например штамм Strерtотусes lасtатdurапs, обладающий повышенной способностью к продукции цефамицина С.

Интересно, что в некоторых случаях  повышение уровня синтеза антибиотиков происходит уже в результате одного или нескольких циклов протопластирования – регенерации протопластов штамма-продуцента. Так, штамм Strерtотусes  fradiae, синтезирующий тилозин, после двух раундов такой обработки втрое увеличил свою продуктивность. Причины этого явления пока не исследованы.

Раздел 2. Иммобилизация ферментов путем поперечных сшивок

Широкие перспективы открылись перед инженерной энзимологией в результате создания нового типа биоорганических катализаторов, так называемых иммобилизованных ферментов. Иммобилизация – это процесс прикрепления ферментов к поверхности природных или синтетических материалов, включение их в полимерные материалы, полые волокна и мембранные капсулы, поперечная химическая сшивка[3]. Иммобилизацию также можно характеризовать как физическое разделение катализатора и растворителя, в ходе которого молекулы субстрата и продукта легко обмениваются между фазами.

При иммобилизации ферментов происходит стабилизация каталитической активности, так как этот процесс препятствует денатурации белков. Иммобилизованный фермент, имеющий ограниченную возможность для конформационных перестроек, быстрее растворимого находит кратчайший путь к функционально активной конформации. Иммобилизованные ферменты приобретают, помимо стабильности, отдельные свойства, не характерные для их свободного состояния, например, возможность функционировать в неводной среде, более широкие зоны оптимума по температуре и рН. 

Длительность сохранения каталитической активности и ряд свойств ферментов определяются правильностью выбора носителя, метода и условий проведения иммобилизации.

Существуют  два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации).

Рис.3. Методы иммобилизации ферментов (Ф -молекула фермента)

 Каждый из этих методов осуществляется разными способами.

Физические  методы иммобилизации ферментов реализуются посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, путем включения энзимов в поры поперечносшитого геля, в полупроницаемые структуры или двухфазные системы.

Адсорбция ферментов на нерастворимых  носителях. При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нельсон, Э.Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. В литературе описано получение адсорбционным способом более 70 иммобилизованных ферментов с использованием главным образом таких носителей, как кремнезем, активированный уголь, графитовая сажа, различные глины, пористое стекло, полисахариды, синтетические полимеры, оксиды алюминия, титана и других металлов[5]. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. Процесс адсорбции ферментов на нерастворимых носителях отличается крайней простотой и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают в мягких условиях. Активность фермента при таком варианте иммобилизации сохраняется практически на 100 %, а удельная концентрация белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

 К  недостаткам адсорбционного метода  следует отнести невысокую прочность  связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность связывания фермента с носителем может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными агентами - полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации подвергается молекула исходного фермента, однако зачастую это ведет к снижению его активности.

Иммобилизация ферментов путем  включения в гель. Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток[4]. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго - гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.

 Иммобилизация  ферментов в гелях обеспечивает  равномерное распределение энзима  в объеме носителя. Большинство  гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования фермента, включенного в его структуру. Однако метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.

Иммобилизация ферментов в полупроницаемые  структуры. Сущность этого способа иммобилизации заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы.

 Первый  способ предложен Т.Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое – в органической фазе. Размер получаемых капсул составляет десятки или сотни микрометров, а толщина мембраны – сотые доли микрометра.

 Достоинства  метода микрокапсулирования – простота, универсальность, возможность многократного использования нативного фермента (фермент может быть отделен от непрореагировавшего субстрата и продуктов реакции процедурой простого фильтрования). Особенно существенно, что методом микрокапсулирования могут быть иммобилизованы не только индивидуальные ферменты, но и мультиэнзимные комплексы, целые клетки и отдельные фрагменты клеток[5]. К недостаткам метода следует отнести невозможность инкапсулированных ферментов осуществлять превращения высокомолекулярных субстратов.

 Близким  к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов ферментов в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем фермент. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор фермента.

 Ферменты, иммобилизованные путем включения  в структуру липосом, используют преимущественно в медицинских и научных целях, ибо значительная часть ферментов в клетке локализована в составе липидного матрикса биологических мембран, поэтому изучение липосом имеет большое значение для понимания закономерностей процессов жизнедеятельности в клетке.

 Химические методы иммобилизации  ферментов. Иммобилизация ферментов путем образования новых ковалентных связей между ферментом и носителем - наиболее массовый способ получения промышленных биокатализаторов.

 В  отличие от физических методов  этот способ иммобилизации обеспечивает  прочную и необратимую связь  фермента с носителем и часто  сопровождается стабилизацией молекулы  энзима. Однако расположение фермента  относительно носителя на расстоянии  одной ковалентной связи создает  стерические трудности в осуществлении каталитического процесса. Фермент отделяют от носителя с помощью вставки (сшивка, спейсер), в роли которой чаще всего выступают бифункциональные и полифункциональные агенты (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутаровый диальдегид и др.). Например, для выведения галактозилтрансферазы из микроокружения носителя между ним и ферментом вставляют последовательность —СН₂—NH—(СН₂)₅—СО— . В этом случае структура иммобилизованного фермента включает носитель, вставку и фермент, соединенные между собой ковалентными связями.