Мікроорганізми в біотехнології

     ЗМІСТ

ВСТУП                                                                                                                 3

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ                                                                                        4

1. Історія  біотехнології                                                                                     4
2. Мікроорганізми – об’єкт біотехнології                                                       6
3. Основні речовини отримані з використанням мікроорганізмів               8

    3.1 Амінокислоти                                                                                        8

         3.1.1 Продуценти амінокислот                                                          9

    3.2 Органічні кислоти                                                                                12

         3.2.1 Продуценти органічних  кислот                                               13

         3.2.2 Продуценти лимонної  кислоти                                                14

         3.2.3 Продуценти молочної  кислоти                                                15

    3.3 Вітаміни                                                                                                16

         3.3.1 Продуценти вітамінів                                                               17

    3.4 Антибіотики                                                                                         19

         3.4.1 Продуценти антибіотиків                                                         20

         3.4.2 Продуценти пеніциліну та граміцидину                                 21

    3.5 Ферменти                                                                                              23

         3.5.1 Продуценти ферментів                                                             24

    3.6 Ліпіди                                                                                                    25

    3.7 Полісахариди                                                                                        27

    3.8 Мікробний білок                                                                                  28

    3.9 Інші синтетичні речовини, отримані  на основі мікроорганізмів    29

4 Генетична  інженерія                                                                                       31

ВИСНОВКИ                                                                                                       33

ЛІТЕРАТУРА                                                                                                     34 

     ВСТУП 
 

    Промислова  біотехнологія – це наука про  найважливіші мікробіологічні процеси  і їх практичне застосування для отримання індустріальним способом цінних продуктів життєдіяльності мікроорганізмів [1].

    Мікробіологічний  синтез виступає як складова і найважливіша частина сучасної біотехнології. Практично  всі основні досягнення біотехнології отримані прямо чи опосередковано при участі мікроорганізмів чи продуктів їх обміну [2].

    Багато  мікроорганізмів володіють помітними  перевагами перед рослинними і тваринними об’єктами , цим і визначається діапазон використання мікроорганізмів в  різних галузях виробничої діяльності людини [3].Успіхи біологічних і інженерних наук дозволяють створити високопродуктивні процеси мікробіологічного виробництва ряду харчових і кормових продуктів, медикаментів та органічних речовин [4].

    В наші дні людина не тільки використовує продукти життєдіяльності організмів, але й управляє внутрішньоклітинними процесами, здійснює направлену модифікацію властивостей організмів, тому впровадження біотехнології з використанням мікроорганізмів веде до створення екологічно чистих технологій в різних сферах людської діяльності, включаючи раціональніше використання природних ресурсів і створення замкнутих виробничих циклів [3].

    Дана  робота розглядає мікроорганізми як об’єкт біотехнології, а саме основних продуцентів промисловоцінних речовин та речовин, що використовуються людиною в різних галузях народного господарства, промисловості та медицині. 
 

    ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 
 

    1 ІСТОРІЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ 
 

    Біотехнологія виникла в давнину (приблизно 6000 – 5000 р до н. е.), коли людина використовувала біотехнологічні процеси при хлібопеченні, готуванні кисломолочних продуктів, у виноробстві тощо. Цей перший етап розвитку біотехнології був суто емпіричний і продовжував залишатися таким, не дивлячись на вдосконалення технологічних процесів і розширення сфер використання біотехнологічних прийомів, але лише завдяки роботам Луї Пастера в середині 19 століття, що доказали зв'язок процесів шумування з діяльністю мікроорганізмів, традиційна біотехнологія одержала наукову основу. [1,2]

    У 40-50-ті роки 20 ст., коли був здійснений біосинтез пеніцилінів методами ферментації, почалася ера антибіотиків, що дала поштовх розвитку мікробіологічного синтезу і створенню мікробіологічної промисловості. [1]

    З цієї миті почався другий науковий етап традиційної  біотехнології. У цей період отримані і виділені ферменти, відкрито багато мікроорганізмів; розроблені способи їх вирощування в масових кількостях,  отримані культури тваринних і рослинних клітин і розроблені способи штучного їх культивування, в результаті вивчення фізіології, біохімії і генетики мікробних і тваринних клітин отримано багато продуктів мікробіологічного синтезу, необхідних для медицини, сільського господарства і промисловості.[1,2]

    У 60-70-ті р. 20 ст. почала бурхливо розвиватися  клітинна інженерія. Зі створенням у 1972 групою П. Берга в США першої гібридної молекули ДНК in vitro формально пов'язане народження генетичної інженерії, що відкрила шлях до свідомої зміни генетичної структури організмів таким чином, щоб ці організми могли робити необхідні людині продукти і здійснювати необхідні процеси.[3] Ці два напрямки визначили образ нової біотехнології, що має мало загального з тією примітивною біотехнологією, що людина використовувала протягом тисячоріч. [4]

    Показово, що в 1970-ті рр. одержав поширення  і самий термін біотехнологія. З цього часу біотехнологія нерозривно пов'язана з молекулярною і клітинною біологією, молекулярною генетикою, біохімією і біоорганічною хімією, мікробіологією. За стислий період свого розвитку (25-30 років) сучасна біотехнологія не тільки домоглася істотних успіхів, але і продемонструвала необмежені можливості використання організмів і біологічних процесів у різноманітних галузях виробництва і народного господарства.[1,5] 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    2 МІКРООРГАНІЗМИ – ОБЄКТ БІОТЕХНОЛОГІЇ 
 

    Мікроорганізми – бактерії, дріжджі і міциліальні гриби – це дивовижно ідеальні творіння природи. Мікробна клітина в змозі жити і розмножуватись , використовуючи в якості джерела харчування часто тільки один єдиний органічний субстрат і мінеральні солі. Бактерії можуть жити в аеробних і анаеробних умовах при температурах, близьких до 0 і +80⁰ С [2]. З другої сторони, такі, форми, як ендоспори, що утворюються рядом бактерій, у деяких видів зберігають властивість проростати навіть після кип’ятіння на протязі 1 – 2 год. У деяких видів бактерій (наприклад, Clostridium botulinum) спори не гинуть при короткочасному підвищенні температури до 160 – 180⁰ С [1]. Досконалий, точно регулюємий метаболізм мікробної клітини дозволяє їй рости і ділитись з великою швидкістю. Так, ділення бактерії  Escherichia coli (кишечка паличка) при рості на повноцінному середовищі проходить кожні 15 хв [6].

    Багато  мікроорганізмів зберігають життєздатність в умовах глибокого вакууму, деякі  організми витримують високі дози ультрафіолетового  чи іонізуючого випромінювання. Ріст мікроорганізмів залежить від активної кислотності (рН) середовища [1]. Так, наприклад штами Acinetobacter sp. B – 7005 та мутант 1НГ є ауксотрофами по пантотеновій кислоті. При культивуванні бактерій на середовищі з етанолом без пантотенату кальцію спостерігали зниження рівня біомаси в 3 рази, запобігти цьому вдалось шляхом внесення ацетату в середовище з етанолом,що запобігає зниженню рН до 4,55 – 4,85 [7]. Для більшості мікроорганізмів оптимум рН близько 7,0, тобто сприятливе нейтральна середовище [1].

    Мікроорганізми  мають високе відношення площі поверхні до об’єму клітини, що забезпечує їм високу швидкість обмінних процесів. Також  для мікроорганізмів характерна пластичність метаболізму, тобто швидка адаптація до оточуючого середовища [6].

    Вся життєдіяльність, всі механізми  мікроорганізму запрограмовані на безперервний ріст і ділення до тих пір, поки оточуюче середовище забезпечує хоча би мінімальні для цього умови. Важливо  відмітити, що всі процеси в бактеріальній  клітині підкоряються строгим правилам економії і ні один із первинних метаболітів не утворюється понад строго необхідних для росту кількостях. Якщо порівняти клітину з машиною, то це дуже досконала машина, що має коефіцієнт корисної дії до 70% [1,6.8].

    Мікроорганізми є найпоширенішою групою живих організмів на планеті, вони займають всі екологічні ніші [6].

    Перечислені унікальні властивості мікробної  клітини роблять можливим ефективне  використання мікроорганізмів в  господарській діяльності людини.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

    3 ОСНОВНІ РЕЧОВИНИ, ОТРИМАНІ З  ВИКОРИСТАННЯМ МІКРООРГАНІЗМІВ 
 

    3.1 Амінокислоти 
 

    В живих клітинах синтезується багато макромолекул (білків, нуклеїнових  кислот, полісахаридів), які відіграють роль структурних компонентів, біокаталізаторів, гормонів, рецепторів чи хранилищ генетичної інформації.

    Амінокислоти  являються будівельними блоками  пептидів і білків та визначають їх біологічні властивості, виконують  ряд інших важливих функцій [9].

    В природі існує близько 300 амінокислот, але в склад природних білків входять лише 20: аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінова кислота, цистеїн, гліцин, глутамінова кислота, гістидин, глутамін, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, оксипролін, пролін, серин, тирозин, треонін, триптофан і валін.  Вісім амінокислот тваринний організм не може синтезувати, їх називають незамінними: фенілаланін, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, треонін, триптофан, валін. Ці амінокислоти повинні постійно надходити з їжею в організм. Нестача однієї з цих амінокислот може стати фактором, що лімітує ріст і розвиток організму [4].

    В останні роки амінокислоти широко використовуються в народному господарстві, особливе значення вони мають для збалансованого білкового харчування. Деякі харчові  і кормові продукти не містять  в своєму складі необхідної кількості незамінних амінокислот (лізин) і для ліквідації можливого дисбалансу їх використовують в чистому вигляді або вводять в склад комбінованих кормів, які випускаються промислово [1]. Препарати амінокислот використовуються також в харчовій промисловості і кулінаріїї в медицині [4]. Вони також використовуються при виготовленні ряду полімерних матеріалів, деяких спеціальних волокон, харчових плівок. Ряд амінокислот або їх похідних мають пестицидну дію [1].   
 

    3.1.1 Продуценти амінокислот 
 

    Мікробіологічний синтез – досить перспективний і економічно вигідний спосіб отримання багатьох амінокислот. В процесі культивування продуцентів амінокислот безпосередньо синтезуються L- амінокислоти. Одна з важливих задач мікробіологічного синтезу амінокислот – отримання високоактивних штамів – продуцентів, частково, з використанням генної інженерії [1].

    Властивість акумулювати в середовищі для  культивування амінокислоти виявлена у багатьох мікроорганізмів. Відносяться  вони до різних таксономічних груп. Серед культур, що являються потенційними продуцентами глутамінової кислоти, виявлено 20% бактерій (з 650 досліджених), 30% стрептоміцетів (з 372), 30% дріжджів (з 468) і 10% мікроскопічних грибів (з 475) [10].

    Більшість досліджених штамів мікроорганізмів, незалежно від їхньої видової приналежності, переважно накопичують α-аланін і глутамінову кислоту. Значно менше штамів і в меншій кількості виділяють аспарагінову кислоту, лейцин, валін, ізолейцин, лізин [1]. Строгої кореляції між видовою приналежністю організму і його властивості накопичувати амінокислоти немає [10].

    Серед продуцентів амінокислот - різні  мікроорганізми представники родів Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Aerobacter, Microbacterium, Eschirichia. Використовувані в промисловості мікроорганізми можна підрозділити на декілька класів: дикі штами, ауксотрофні мутанти, регуляторні мутанти і ауксотрофні регуляторні мутанти. Промислові штами, як правило, несуть декілька мутацій, що використовують механізми регуляції цільової амінокислоти і її попередників [11].

    Мікроорганізми  зазвичай синтезують кожну амінокислоту в визначеній кількості, це пояснюється  контролем як на рівні генів біосинтезу кожної амінокислоти, так і рівні  ферментів. Такий контроль виключає пере продукування амінокислот, і виділення  їх з клітини можливе лише в у мікроорганізмів з порушеною системою регуляції [5]. В природних умовах та порушення достатньо  рідкісні, тому для отримання промислових продуцентів довелося йти по шляху отримання мутантів, що мають генетичний дефект регуляторного контролю процесу біосинтезу потрібних  амінокислот [13].

    L - глутамінова кислота - перша амінокислота, отримана на основі промислового мікробіологічного синтезу.  В якості продуцентів брали дикі штами глутаматпродукуючих коринебактерій [12].  Найбільш поширеними продуцентами глутамінової кислоти являються штами бактеріальних культур Corynebacterium glutamicum і Brevibacterium flavum [14].

    Одним з перших методів мікробіологічного  синтезу глутамінової кислоти був  метод ферментативної трансформації 2-кетоглутарової кислоти, метод, що використовує високу глутаматдегідрогеназну активність деяких мікроорганізмів, зокрема Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens та інших [1].

    В інституті мікробіології  вченими  розроблена технологія отримання глутамінової кислоти з використанням мутанта Corynebacterium glutamicum 541 Р [14].

    Деякі продуценти, наприклад Corynebacterium glutamicum, можуть при зміні умов культивування накопичувати L-глутамін, який, можливо, утворюється з глутамінової кислоти [1].  

    Corynebacterium glutamicum. Група 20. Неспороутворюючі грампозитивні палички неправильної форми [15].

    Прямі чи злегка вигнуті палички з загостреними чи іноді булавовидними кінцями, 0,3-0,8х1,5-8,0 мкм. Нерухомі, кислотонестійкі, факультативні анаероби. Потребують багатих поживних середовищ, метаболізм бродильного типу, каталазо позитивні [16].

    У коринебактерій здатність забарвлюватись за Грамом може змінюватись з віком  культури. Встановлено, що природна дисоціація культур за цією ознакою дорівнює 0-0,1% загальної кількості клітин, тоді як при культивуванні на середовищі з ПАР -0,3-100%. Також процес вирощування коринебактерій на середовищах з ПАР супроводжується зміною антигенних властивостей і антибіотикочутливості досліджуваних штамів [17].

    Brevibacterium flavum. Група 20. В молодих культурах палочки неправильної форми, 0,6-1,2х1,5-6 мкм, одиночні чи в парах. Може зустрічатись розгалуження але міцелій не утворюється. Грампозитивні, облігатні аероби, каталазопозитивні. Широко поширені в молочних продуктах [16]. Можуть рости на м’яких  сирах, володіють незначною протеолітичною активністю [18].

    Bacillus subtilis. Група 18. Прямі палочки , 0,5-2,5х1,2-10 мкм, з закругленими кінцями. Грампозитивні, рухомі, споро утворюючі , аероби, хемоорганотрофи, каталазо позитивні [16].

    Pseudomonas fluorescens..Прямі чи злегка вигнуті, але не спіральні палички, 0,5-1,0х1,5-5,0 мкм. Рухомі за рахунок полярних джгутиків, аероби, метаболізм чисто дихального типу з використанням кисню в якості кінцевого донора електронів [18].

    Для виробництва аланіну використовують представників роду Corynebacterium і Brevibacterium, а саме Corynebacterium gelatinosum i Brevibacterium amylolyticum [14].

    Продуценти  лізину – глутаматпродукуючі коринебактерії Corynebacterium glutamicum і Brevibacterium flavum- мають єдину амінокислоту, активність якої регулюється шляхом узгодженого інгібування по принципу оборотного зв’язку треоніном і лізином. Синтез треоніну залежить від активності гомосериндегідрогенази,  лізину-каталізується дигідроколінат синтетазою [12].

    Мікробіологічний синтез L-триптофану здійснюють на основі штамів мутантів дріжджів (Candida) і бактерій (Escherichia coli, Bacillus subtilis), дефіцитних по Тирозину і фенілаланіну. Промисловий синтез L-триптофану здійснюється на основі сахарів [11].  
 

    3.2 Органічні кислоти 
 

    Органічні кислоти широко використовують в  харчовій і фармацевтичній промисловості, в техніці і як хімічна сировина. Більше 50 органічних кислот можуть бути отримані на основі мікробіологічного синтезу. Біотехнологічні методи їх отримання на теперішній час детально розроблені. Більш того,прийнято вважати, що органічні кислоти,отримані в результаті мікробіологічного синтезу, кращі для використання людиною, в порівнянні з синтетичними кислотами [1].

    Харчові кислоти раніше, в обмеженій кількості, виділяли із природних джерел, лимонну кислоту – із соку лимонів, винну – із винного каменю. Зараз мікробіологічне отримання органічних кислот базується на аеробному бродінні [11]. В залежності від кінцевих чи переважаючих продуктів розрізняють спиртове, молочнокисле, маслянокисле, ацетонобутилове та інші види бродінь. В результаті неповних окиснень утворюються оцтова, лимонна, глюконова, ітаконова і ряд інших кислот [10].

    Кислоти, методи отримання яких розроблені достатньо  детально, приводяться в табл. 1. На теперішній час в промислових масштабах  мікробіологічним шляхом синтезується тільки 6 кислот: лимонна, глюконова, ітаконова, 2 – кетоглюконова , оцтова та молочна [1]. 
 

    3.2.1 Продуценти органічних кислот 
 

    Властивість продукувати органічні кислоти  при рості на середовищах з вуглеводами широко розповсюджена серед міциальних грибів родів Aspergillus (Aspergillus awamori, Aspergillus clavatus, Aspergillus fumaricus, Aspergillus itaconicus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus aterreus, Aspergillus awentil), Penicillium (Penicillium chrysogenum, Penicillium citrinium, Penicillium citrogenum, Penicillium tutenum) i Rhizopus (Rhizopus nigricans, Rhizopus oryzae) [1].

    Також, як продуценти використовують бактеріальні дріжджові і грибні культури Lactobacillus, Arthrobacter, Alcaligenes, Candida, Trichoderma [11].

    Глюконову кислоту найчастіше отримують використовуючи гриби родів Aspergillus і Penicillium. Продуценти глюконової кислоти містять активний фермент – глюкозооксидозу, що каталізує окиснення альдегідної групи в молекулі глюкози [4].

    Продуцентами  фумарової кислоти можуть бути різні  види грибів: Penicillium griseofulvum, Aspergillus glaucus, Aspergillus flavus, Aspergillus onici, Caldariomyces fumago. Найбільш активно продукують фумаролу кислоту мукорові гриби, особливо ті,що відносяться до роду Rhizopus [1].

    Цінним  вихідним матеріалом для виробництва синтетичного нітронного волокна є ітаконова кислота. На експериментальному заводі біохімічних препаратів інституту мікробіології в Латвії було розроблено технологію отримання ітаконової кислоти із сахарози за допомогою культури Aspergillus terreus [4].

    Основні продуценти органічних кислот наведені а таблиці 3.2.1.1 

    Таблиця 3.2.1.1 – Основні органічні кислоти, що продукуються мікроорганізмами [1]

    3.2.2 Продуценти лимонної кислоти 
 

    У промисловому виробництві лимонної кислоти як продуцент в основному використовують Aspergillus niger, але також застосовують і A. Wentii [11]. Штами, що використовуються в промисловості характеризуються великою швидкістю росту, легкістю культивування і високим виходом цільового продукту [1].

    Aspergillus niger належить до класу дейтероміцетів, або недосконалих грибів (Deuteromycetes або Fungi imperfecti), порядку Hyphomycetales [19]. Розмножується як вегетативно, так і за допомогою спор, які утворюються на кінці виростів конідієносців – стеригм в вигляді прямих ланцюжків [4]. Статевого розмноження немає ,тому можна сказати, що недосконалі гриби – конідіальна стадія аскоміцетів, у яких стадія асків ще не виявлена або ж втрачена в процесі еволюції [18]. Конідієносці  Aspergillus утворюються із вегетативних клітин міцелію в вигляді прямих вертикальних, нерозгалужених гіф, що мають на кінці пухирець. Потрапивши на поживне середовище , спора проростає і утворює виріст – гіф, який продовжує рости, розгалужуватись, переплітатись, утворюючи міцелій [4].

    Мікрофлора, що супроводжує продукування грибом Aspergillus niger лимонної кислоти,знижує його властивість до синтезу, прямо до повного його подавлення. Антагоністами являються інші гриби:дріжджові та плісняві [20].

    Деякі бактерії – Bacillus licheniformis, Bas subtilis, Bravibacterium flavum, Arthrobacter paraffineus, можуть утворювати лимонну кислоту при рості в середовищі з глюкозою, ізоцитратом чи вуглеводами. Бактерії в цьому плані ще мало вивчені, але представляють практичний інтерес як продуценти лимонної кислоти, так як ростуть швидше, ніж гриби, і використовують більше різних субстратів при утворенні цитрату [21]. 
 

    3.2.3 Продуценти молочної кислоти 
 

    В промисловості молочну кислоту  отримують , використовуючи  Lactobacillus delbrueckii, термофільні з оптимумом температури розвитку 45⁰ – 50⁰ С [4]. Належать до 19 групи, грампозитивні палички, правильної форми, зазвичай в коротких ланцюжках. Спор не утворюють, факультативні анаероби, потребують багатих і складних середовищ, каталазо негативні , не містять цитохромів [16].

    Зараз ведуться дослідження щодо можливості регуляції росту лактобактерій фізичними методами in vitro, а саме за допомогою нового приладу – комплексу медичного експертного (КМЕ) та апарату “CEM Tech”. Було встановлено,що максимальні відходи біомаси для штаму Lactobacillus delbrueckii – 146% при висіванні лактобактерій, “прокачених” маркерами та аутоспектрами відповідного штаму, на “непрокачене” поживне середовище. Показана можливість регуляції (стимуляції/ пригнічення) росту клітин молочнокислих бактерій роду Lactobacillus фізичними методами за допомогою КМЕ (обробка клітин і поживного середовища спектрально динамічними характеристиками) і про дії апарату “CEM Tech” (вплив електромагнітного випромінювання кристалів арсеніду галію на поживне середовище і клітини бактерій). Не виявлено значних змін в морфологічних признаках під дією вивчених фізичних методів [22].