Введение новой генетической информации в клетки бактерий

     ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………...……………………………………………….3

ГЛАВА 1. ТЕОРИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР…………………………………..5

1.1. История исследования…………………………………………… …..5

1.2. Введение  новой генетической информации  в клетки бактерий…… ..5

ГЛАВА 2. Методы извлечения плазмидной ДНК…………………..…..10

2.1 Метод  с применением бромистого этидия…………………………..10

2.2Метод  центрифугирования в градиенте  концентрации хлористого

цезия………………………………………………………………………...12

2.3 Щелочной  метод……………………………………………………….13

ГЛАВА 3. Результаты исследований …………………………..………..13

Бактериальная культура……………………………………….…….……15

Выделение плазмидной ДНК……………………………………….…….18

Рестрицирование……………………………………………..…………....22

Электрофореграмма……………………………………………...……….24

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………..……...….………..27

ПРИЛОЖЕНИЕ……………………………………………..……………..28

ЛИТЕРАТУРА………………………………………………….…..……...29 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Введение

     Актуальность. Данная работа посвящена плазмиде, внехромосомному самовоспроизводящимуся генетическому элементу (фактору наследственности) бактерий и некоторых других организмов. Она стабильно наследуется. Представляет собой кольцевую или линейную двухцепочечную молекулу ДНК, закрученную в суперспираль. Использование плазмид, как векторов с вирусными ДНК имеет неоценимое значение для генной инженерии. Является одним из основных ее методов. Громадные потенциальные возможности этой методологии обусловлены не только тем, что с ее помощью можно конструировать и реплицировать рекомбинантную ДНК, но и тем, что она позволяет клонировать отдельные рекомбинантные молекулы ДНК. Таким образом теоретическая и практическая значимость изучения данной проблемы не вызывает сомнения, что и вызвало интерес к ее изучению.

     Цель  исследования. Выделение плазмиды pFF из бактериальной культуры и ее характеристика.

     В соответствии с целью, объектом и  предметом исследования определены следующие задачи:

1. Изучить литературу по проблеме исследования.
2. Выделить плазмиду.
3. Охарактеризовать ее.
4. Сформулировать выводы.

     Объект – клетки Escherichia coli.

     Предмет – плазмидные ДНК.

     Гипотеза. При правильно приготовленных растворах и четко отработанных действиях, выделение и последующие преобразования проходят наиболее успешно.

     Исследование  проводится лабораторным методом. В  ходе работы осуществляется анализ литературы, наблюдение и проверочный качественный эксперимент осуществляемый такими методами как: щелочной метод выделения плазмидных ДНК, методом рестрикции; методом электрофореграммы.

     Структура научно-исследовательской  работы: работа состоит из введения, двух глав, заключения, приложения и использованной литературы.

     ГЛАВА 1

     ТЕОРИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

     1.1 ИСТОРИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

     Примерно  к 1970 г. стали известны основные свойства генетических систем. Несмотря на отсутствие многих важных деталей, удалось установить принципы репликации, рекомбинации и  репарации и каждый из этих процессов  был воспроизведен in vitro. В этот период выдающихся открытий неожиданной наградой исследователям стала идентификация  многих ферментов, для которых нуклеиновые  кислоты являются субстратом. Получение  их в очищенном виде и определение  свойств в значительной мере облегчило  анализ структуры и функций нуклеиновых  кислот, а применение в дальнейших исследованиях привело к созданию новой области молекулярной биологии - технологии рекомбинантных ДНК.

     Они ведут начало от экспериментов в  сфере бактериальной генетики, и  особенно большую роль здесь сыграла  возможность введения молекул ДНК  в клетки бактерий. Такая введенная  ДНК независимо от того, произошла  ли она из бактериофага или из других бактериальных клеток, изменяет генотип, а нередко и фенотип реципиентной клетки. Гены донорной ДНК способны экспрессироваться и могут рекомбинировать  с хромосомной ДНК.

     1.2 Введение новой  генетической информации  в клетки бактерий

     Бактерии  могут приобретать новый генетический материал несколькими способами. Это:

     1) трансформация, при которой в  клетки проникают молекулы ДНК,  добавленные в культуральную  среду;

     2) конъюгация, в процессе которой  ДНК непосредственно переносится  от одной клетки к другой;

     3)Трансдукция,  опосредуемая бактериофагами, при  которой новая генетическая информация  вводится в клетку с частицей  бактериофага. Независимо от способа  попадания в реципиентную клетку  донорная ДНК рекомбинирует с  гомологичными участками или  специфическими сайтами в геноме  реципиентного организма или  сохраняется в виде автономной  мини-хромосомы, изменяя таким  образом генотип хозяина.

     Трансформация, т.е. изменение генотипа клетки путем  внесения в нее молекул ДНК  из культуральной среды, была первым из способов введения новых генов  в клетки бактерий. Это послужило  также первым доказательством роли ДНК как носителя генетической информации. Если в клетки организма с определенным генетическим нарушением ввести ДНК, выделенную из нормальных клеток, то у этого  организма нередко восстанавливаются  утраченные функции. Такая трансформация  является обычно наследственной и стабильной, поскольку в ее основе лежит рекомбинация между функциональным геном донорной ДНК и дефектным геном реципиента. Однако осуществляемая с помощью  ДНК трансформация оказалась  полезной только при изучении молекулярной генетики прокариот. В других случаях  возможности трансформации ограничивались трудностями выявления трансформирующего  гена, что делало нереальным определение  его структуры. Тем не менее принцип  трансформации нашел применение в другой области. Например, получение  трансформированных клеток является важным этапом во многих экспериментах с  рекомбинантными молекулами ДНК. Термин «трансформация» используется в  молекулярной биологии эукариот для  обозначения стабильного изменения  генотипа и фенотипа клетки.

     При конъюгации осуществляется прямой перенос  ДНК из одной клетки в другую при  их контактировании. В тех случаях, когда конъюгация происходит между  определенными штаммами E. coli, один из них выполняет функции донора, другой - реципиента. Эти эксперименты впервые показали, что все гены Е. coli расположены на одной кольцевой молекуле ДНК. Сравнивая время, необходимое для переноса различных генов во время конъюгации, можно построить генетическую карту хромосомы Е. coli, т.е. установить порядок следования хромосомных генов.

     Охарактеризованы  два типа трансдукции, осуществляемой с помощью бактериофагов, общая  и специфическая. При общей трансдукции  фаговые частицы, содержащие сегменты ДНК клетки-хозяина, переносят относительно протяженные участки геномной ДНК  от одной бактериальной клетки к  другой. Трансдуцирующие фаговые  частицы образуются в ходе определенных инфекционных процессов, когда ДНК  клетки эффективно деградирует и  фрагменты, по размеру примерно соответствующие  фаговому геному, случайно упаковываются  в зрелые частицы бактериофага. В  результате последующего инфицирования  клеток бактерий популяцией фаговых  частиц, содержащей трансдуцирующие  фаги, происходит передача ДНК донорных клеток этим инфицируемым клеткам. Рекомбинация между введенными фрагментами донорной ДНК и ДНК клетки-реципиента приводит к изменению генотипа последней. Каждая трансдуцирующая фаговая  частица обычно содержит только один случайный фрагмент исходной донорной хромосомы. Вероятность включения  в такую частицу любой части  этого генома примерно одинакова. Однако благодаря довольно большому размеру  трансдуци-руемых сегментов ДНК  обычно реципиентная клетка приобретает  за один акт трансдукции целую  группу генов. В результате гены, тесно  сцепленные друг с другом в хромосоме  донора, с высокой частотой котрансдуцируются, тогда как гены, удаленные друг от друга, трансдуцируются независимо. Определение частоты котрансдукции  генов помогает уточнить генетические карты, позволяя оценить относительные  расстояния между тесно сцепленными  генами. 

     Трансдукция второго типа, специфическая, свойственна  бактериофагам, инфекционный цикл которых  прерывается в результате включения  генома вируса в специфический хромосомный  локус ДНК инфицированной клетки. Бактерии, содержащие такие интегрированные  фаговые геномы, получили название лизогенных. Они несут вирусные геномы как наследственные элементы в своих  собственных хромосомах. В лизогенной клетке вирусные и клеточные геномы реплицируются как единое целое  и являются взаимно совместимыми. Интеграция фагового генома с геномом  клетки-хозяина лишает фаг возможности  вызывать гибель клетки и продуцировать  инфекционное потомство. По этой причине  бактериофаг, способный лизогенизировать, в отличие от вирулентного фага получил  название умеренного. При определенных условиях - индукции - лизогенное состояние  прерывается и вирусный геном  вырезается из хромосомы клетки-хозяина. Он реплицируется, образует множество  вирусных частиц и убивает клетку. Обычно вырезание вирусного генома происходит очень точно, и образующийся фаг содержит вирусный геном, полностью  соответствующий исходному. Иногда, однако, фаговый геном вырезается неправильно и в дочерние фаговые  геномы включаются хромосомные гены, прилегавшие к интегрированному вирусному геному. Эти гены включаются вместо некоторых вирусных генов. Во время следующего цикла инфекции гены клетки-донора переходят вместе с фаговыми генами в реципиентные клетки. После включения ДНК трансдуцирующего фага в геном реципиента клетка приобретает  наряду с фаговыми генами генетическую информацию предыдущего хозяина  фага. Таким образом, при специфической  трансдукции фаг служит вектором для переноса генов из одной клетки в другую. С помощью этого механизма  трансдуцируются только те хромосомные  гены клетки-хозяина, которые тесно  сцеплены с сайтом интеграции вирусного  генома.

     Методология получения рекомбинантных ДНК основана на тех же принципах, что и трансдукция.

     Молекулы  ДНК, способные реплицироваться  в соответствующих клетках, представленные вирусными геномами или плазмидами, служат переносчиками, или векторами, «чужеродных» сегментов ДНК, получивших название вставки. При этом, вместо того чтобы полагаться на клеточные  процессы, ведущие к образованию  рекомбинантных трансдуцирующих геномов, проводят объединение, или рекомбинацию, соответствующим образом модифицированных вставок и векторов in vitro с помощью  фермента ДНК-лигазы. Такие рекомбинантные ДНК вводят затем в соответствующие  клетки, где они амплифицируются  в результате репликации.

     ГЛАВА 2

     РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

     2.1 Метод с применением бромистого этидия

     В присутствии бромистого этидия различие в плавучей плотности плазмидной и хромосомной ДНК становится еще более значительным. Связываясь с линейной двухцепочечной ДНК, этот краситель встраивается между плоскостями  оснований (интеркалирует), вызывает расплетание  двойной спирали, увеличивает длину  линейных фрагментов хромосомной ДНК  и приводит к снижению ее плавучей плотности. В плазмидной ССС-ДНК  интеркаляция красителя вызывает образование  компенсаторных сверхспиральных витков, и при достаточно большом их числе  встраивание следующих молекул  бромистого этидия становится невозможным.

     При равновесном центрифугировании  в градиенте насыщенного раствора хлористого цезия в присутствии  бромистого этидия плазмидная ДНК имеет  более высокую плавучую плотность, чем хромосомная, и концентрируется  в полосе, расположенной ниже, чем  полоса хромосомной ДНК. Обычно эта  полоса имеет красный цвет и ее не нужно визуализировать в УФ-свете. РНК при центрифугировании осаждается на дне пробирки.

     Чтобы отобрать плазмидную ДНК после центрифугирования, пробирку прокалывают сбоку на нужной высоте иглой, надетой на шприц, и  отсасывают материал. Обычно препарат плазмидной ДНК после центрифугирования  в равновесном градиенте плотности  в присутствии красителя содержит очень мало РНК и белков и они  не влияют на последующие манипуляции  с плазмидной ДНК. При необходимости  примеси белков можно удалить  экстракцией фенолом/хлороформом, а  примеси РНК — центрифугированием или хроматографией. Если провести ультрацентрифугирование не удается, то процедуру вьщеления из больших  объемов культуры можно довести до п. 8, а потом до переосаждения этанолом удалить белковые примеси, как это описано в протоколе.

     Методика 

     1. Одну бактериальную колонию (полученную  в результате эксперимента по  трансформации, как это описано  в протоколе 13.1, или ранее расштрихованную  из хранящейся в глицерине  бактериальной культуры) вносят  в неплотно закрытую пробирку  на 15 мл с 2 мл LB-среды, содержащей  соответствующий антибиотик. Растят  бактериальную культуру при интенсивном  встряхивании (200 об/мин) при 37 С  в течение ночи до ОД600=1Д 

     2. Переносят 1,5 мл культуры в  микроцентрифужную пробирку и  собирают клетки центрифугированием  при 12 000 g в течение 1 мин. Оставшуюся  культуру хранят при 4 С. 

     3. Отсасывают супернатант и при  интенсивном встряхивании ресуспендируют  осадок бактериальных клеток  в 100 мкл холодного раствора I. Инкубируют во льду 15 мин.

     4. Добавляют 200 мкл раствора II и  перемешивают смесь быстрым пятикратным  переворачиванием закрытой пробирки  без встряхивания. Инкубируют пробирку  во льду 5 мин. 

     5. Добавляют 150 мкл буфера 111, закрывают  пробирку и перемешивают содержимое  осторожным встряхиванием в течение  10 с. Инкубируют во льду 10 мин. 

     6. Центрифугируют на микроцентрифуге  при 12 000 g в течение 5 мин при  4 С и отбирают супернатант в новую пробирку.

     7. Для осаждения двухцепочечной  ДНК добавляют 1 мл холодного  этанола, перемешивают встряхиванием  и на 30 мин помещают на —20 С. 

     8. Центрифугируют на микроцентрифуге  при 12 000 g в течение 5 мин при  4 С. 

     9. Осторожно отбирают супернатант  и ресуспендируют осадок в  100 мкл раствора IV.

     10. Добавляют 200 мкл этанола, перемешивают  и на 10 мин помещают на —20 °С. Центрифугируют на микроцентрифуге  при 12 000 g в течение 2 мин при 4 °С.

     11. Отбирают супернатант, добавляют  к осадку 1 мл этанола, центрифугируют  на микроцентрифуге при 12 000 g в  течение 2 мин при 4°С.

     12. Отбирают супернатант, осадок  нуклеиновых кислот подсушивают  на воздухе в течение 10 мин.  Растворяют нуклеиновые кислоты  в 50 мкл ТЭ и хранят при  -20 С. 

     Обычно  метод, описанный в протоколе, дает при выделении многокопийных  плазмид типа pUC выход 3-5 мкг ДНК  на 1 мл исходной бактериальной культуры. Если полученные таким способом мини-препараты  ДНК не удается рестрицировать, то для удаления загрязнений можно  провести экстракцию фенолом/хлороформом. Пропорционально увеличив количество всех необходимых реактивов, можно  использовать данный метод для выделения  ДНК из культур объемом до 10 мл.

     2.2 Метод центрифугирования  в градиенте концентрации  хлористого цезия

     Высокоэффективным методом разделения нуклеиновых  кислот, широко используемым при их очистке, является центрифугирование  в градиенте плотности хлористого цезия . В этом случае высокая ионная сила буферного раствора в центрифужных пробирках способствует диссоциации  комплексов белков и нуклеиновых  кислот, и разделение макромолекул происходит на основании их различий в плавучей плотности. Перемещение  макромолекул во время центрифугирования происходит до тех пор, пока они не достигнут зоны раствора CsCl с плотностью, равной их плавучей плотности. В этой зоне происходит их концентрирование. Метод центрифугирования в градиенте плотности CsCI в присутствии бромистого этидия используется в генной инженерии для получения векторных плазмид в препаративных количествах. Он позволяет отделять суперскрученные молекулы ДНК от релаксированных и линейных, так как их плавучие плотности заметно различаются из-за разного количества молекул бромистого этидия, интеркалированного в эти топологические изомеры плазмидной ДНК. В практической генной инженерии для очистки векторных плазмид центрифугирование в градиенте плотности CsCI используется редко. В целях обычного применения рекомбинантных ДНК, в том числе для молекулярного клонирования, построения рестрикционных карт и определения последовательности нуклеотидов (секвенирования), разработаны методы минипрепаративного выделения. В одном из них суперскрученные молекулы рекомбинантных плазмидных ДНК легко отделяются от линейных молекул хромосомной и плазмидной ДНК в процессе щелочной денатурации с последующей быстрой нейтрализацией раствора. При этом в основном успевают ренатурировать только суперскрученные молекулы ДНК, так как две их цепи остаются физически связанными друг с другом в процессе денатурации. Образовавшийся комплекс денатурированной ДНК и белков отделяется от плазмидной ДНК центрифугированием, а от основной массы РНК освобождаются переосаждением в присутствии высокой концентрации LiCl.

     2.3 Щелочной метод

     В основе щелочного метода лежит то, что в щелочных условиях (при рН ~ 12) происходит денатурация только линейных молекул ДНК (т. е. разделение цепей двухцепочечной ДНК клетки-хозяина), плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют. При нейтрализации клеточного экстракта  в присутствии солей высокой концентрации денатурированная хромосомная ДНК выпадает в осадок, поскольку реассоциация длинных линейных одноцепочечных молекул ДНК происходит в этих условиях одновременно во множестве участков с образованием нерастворимых комплексов.

     ГЛАВА 3

     РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЙ

     3.1 БАКТЕРИАЛЬНАЯ КУЛЬТУРА

     Бактериальная культура — искусственно выращиваемое на питательных средах скопление  бактерий одного вида, являющихся потомками  одной бактериальной клетки. Бактериальные  культуры сохраняется на твердых (1,5—2% мясо-пептонный агар), полужидких (0,5—0,7% мясо-пептонный агар) или жидких (мясо-пептонный бульон) питательных средах.

       Для длительного хранения бактериальную  культуру лиофилизируют  и  помещают в ампулы. При отсутствии  лиофильной сушки бактериальные  культуры хранят в пробирках  на питательных средах; стерильную  ватную пробку вдвигают внутрь  пробирки и заливают тонким  слоем парафина. Для хранения  бактериальных культур удобно  пользоваться пробирками с навинчивающимися  пробками. Большинство бактериальных  культур лучше сохраняется при  температуре не выше 5—7°.

       Пробирки или ампулы с бактериальной  культурой снабжают этикетками  с указанием названия, номера  и даты выделения. Все бактериальные  культуры, выделяемые или хранящиеся  в лаборатории, подлежат регистрации  в соответствии со специальными  инструкциями. См. также Бактериологическое  исследование, Колония бактериальная.

     Бактериальная культура — культивирование популяций  бактерий на тех или иных питательных  средах. Культивирование бактерий на искусственных питательных средах лежит в основе всех микробиологических исследований, позволяющих выяснить морфологические, физиологические  и другие особенности бактерий.

       В зависимости от питательных  потребностей бактерий бактериальные  культуры могут быть получены  на средах, в состав которых  входят органические субстраты,  или на солевых синтетических  средах, включающих в качестве  источника энергии углеродсодержащие  соединения. При посеве бактерий  на питательные среды наблюдается  сложный процесс роста бактериальных  культур, в котором следует  различать рост (увеличение размера)  отдельных бактериальных клеток  и их размножение, т. е. нарастание  числа жизнеспособных особей. Рост  отдельных бактерий можно наблюдать  под микроскопом или путем  микрокиносъемки в специальных  камерах, процесс же размножения  анализируют путем высева на  плотные питательные среды с  последующим подсчетом числа  бактериальных колоний.

       В процессе культивирования происходит  не только размножение, но и  отмирание бактерий. Следовательно,  полное представление об интенсивности  размножения клеток бактериальных  культур можно получить только  в том случае, если подсчитывать  не только число жизнеспособных  особей, но и общее количество  бактерий.

       Процесс размножения складывается  из следующих фаз: 1) приспособления (lag-фаза), 2) интенсивного деления  (log-фаза), 3) отрицательного ускорения, 4) стационарной фазы максимума, 5) ускоренной гибели, 6) логарифмической  гибели, 7) уменьшения скорости отмирания.  В начале lag-фазы, т. е. сразу  после посева бактерий в питательную  среду, клетки не делятся, иногда  наблюдается уменьшение числа  жизнеспособных особей; затем бактерии  начинают расти, а к концу  lag-фазы и делиться. Логарифмическая  фаза роста бактериальных культур  (log-фаза) характеризуется максимальной  скоростью деления клеток, увеличение  числа которых происходит в  геометрической прогрессии. При  этом абсолютное большинство  клеток делится с равной скоростью,  а гибель их минимальна. В фазе  отрицательного ускорения время  генерации клеток постепенно  удлиняется, а скорость деления по сравнению с log-фазой снижается. Это связано с истощением питательной среды, нарушением кислородного снабжения и накоплением токсических продуктов метаболизма. Одновременно со снижением скорости деления увеличивается процент погибающих клеток, что приводит к замедлению темпа нарастания жизнеспособных особей в бактериальной культуре. Следующая фаза—стационарная — характеризуется равновесием процессов размножения и гибели клеток, вследствие чего число жизнеспособных бактерий в 1 мл среды остается постоянным. Это число соответствует максимальной концентрации (М-концентрация) жизнеспособных особей бактериальной культуры. В течение последующих фаз гибель клеток превалирует над увеличением их числа, в результате чего количество жизнеспособных бактерий снижается. Продолжительность фаз роста Б. к., время генерации и М-концентрация клеток зависят от вида бактерий, состава среды, посевной дозы, возраста культуры и ряда других факторов.

       С целью получения больших  количеств бактериальной массы  аэробов бактериальные культуры  выращивают в условиях искусственной  аэрации. Это позволяет достигать  значительно более высоких М-концентраций  по сравнению с неаэрируемыми  бактериальными культурами. Длительное  сохранение бактериальных культур  в состоянии log-фазы достигается  путем постепенного и постоянного  обновления среды (проточное культивирование). При выращивании ауксотрофных  мутантов бактерий, т. е. бактерий, утративших способность синтезировать  какое-либо вещество (аминокислота, азотистое основание и др.), могут  быть созданы условия так называемого  хемостата, обеспечиваемые постоянным  добавлением в среду необходимого  вещества в определенной концентрации. Варьируя количество вносимого  в среду соединения, меняют скорость  деления ауксотрофных мутантов  бактерий. Условия хемостата могут  быть созданы и для бактерий  дикого типа в том случае, если они не способны синтезировать какие-либо необходимые для питания вещества.

       Все сказанное относится к  чистым бактериальным культурам,  т. е. к популяциям бактерий  одного штамма. Штамм — более  узкое понятие, чем вид (см.). Термином «штамм» обозначают  сохраняемые и перевиваемые бактериальные  культуры того или иного вида  бактерий, полученные из различных  источников. Выделение чистых Б.  к. и их культивирование производят  специальными методами (см. Бактериологическая  техника). В естественных условиях  чистые Б. к. обнаруживаются  крайне редко. Сапрофитные бактерии, обычно населяющие организм человека  и животных, а также обитающие  во внешней среде, составляют  естественные биоценоза (см.), для  которых характерны явления антагонизма,  синергизма и т. п. В случае  инфицирования организма патогенные  бактерии также размножаются  в смешанных популяциях. Следовательно,  если для диагностики инфекций  и идентификаций бактерий обязательным  условием служит выделение чистых  бактериальных культур, то для  изучения процессов, лежащих в  основе развития инфекционных  заболеваний, целесообразен анализ  явлений, возникающих в смешанных  Б. к. , которые состоят из популяций  бактерий различных видов и  штаммов. 

     3.2 ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

     В основе щелочного метода лежит то, что в щелочных условиях (при рН ~ 12) происходит денатурация только линейных молекул ДНК (т. е. разделение цепей двухцепочечной ДНК клетки-хозяина), плазмидные же ССС-молекулы не денатурируют. При нейтрализации клеточного экстракта  в присутствии солей высокой  концентрации денатурированная хромосомная  ДНК выпадает в осадок, поскольку  реассоциация длинных линейных одноцепочечных молекул ДНК происходит в этих условиях одновременно во множестве  участков с образованием нерастворимых  комплексов.

     1. растить ночную культуру 16-24 часа  в богатой среде: 37oС, 200-300rpm;

     2. 1.5ml ночной культуры поместить  в 1.7ml пробирку, ЦФ 30'', удалить супер;

     3. п.2. - ещё 2 раза;

     4. ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки  среды;

     5. ресуспензировать осадок в 200µl  раствора "I", вортекс 5'';

     6. NT, 5';

     7. + 400µl раствора "II", резко вылить, сразу же резко встряхнуть. перевернуть  ~5 раз;