Принципы ДНК-наноархитектоники: вопросы применения

Министерства Образования  и Науки Российской Федерации

ФГАОУ ВПО «СКФУ»

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

на тему: «Принципы ДНК-наноархитектоники: вопросы применения»

 

 

 

 

 

 

Выполнил: студент 4-го курса

группы НЭ-091

Лысенко А.С.

Проверил: к.м.н., доцент

Будкевич Е.В.

 

 

 

Ставрополь, 2013 г.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ                                                                                                             2

Перспективы практического применения ДНК-наноконструкций            6

Методы исследования структуры  ДНК-нанообъектов                            13

ЗАКЛЮЧЕНИЕ                                                                                           16

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ                                                   17

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Принцип комплементарности Уотсона-Крика, на котором основано взаимодействие молекул нуклеиновых кислот, определяет их интенсивное использование в разнообразных молекулярно-биологических приложениях, связанных с образованием стабильных и сиквенс-специфичных комплексов, таких как полимеразная цепная реакция, гибридизационный анализ, антисенс-подходы и других. Программируемая самоорганизация многокомпонентных комплексов ДНК, направление которой задается при выборе нуклеотидных последовательностей составных частей, послужила основным стимулом к появлению кардинально новой области применения нуклеиновых кислот — структурной ДНК-нанотехнологии, или ДНК-архитектоники. Работы в данной области направлены на создание структур определенной формы и пространственной организации с использованием молекул ДНК в качестве строительных элементов с программируемой способностью к самоассоциации.

Молекулы ДНК являются уникальным объектом для получения наноконструкций по ряду причин:

• параметры структуры различных комплексов на основе ДНК-цепей (дуплексы, триплексы, квадруплексы и т.д.) известны и являются величинами нанометрового диапазона;
• разработаны и автоматизированы методы синтеза немодифицированных (нативных) молекул нуклеиновых кислот и их производных;
• детально изучена термостабильность ДНК-комплексов в зависимости от нуклеотидной последовательности и различных внешних факторов (природы катионов, НК-специфичных лигандов, сорастворителей и т.д.), определены основные принципы процесса самоассоциации ДНК-нитей, что важно для программирования формы получаемых ДНК-объектов и снижения эффективности образования побочных продуктов;
• разработаны методики введения различных модифицирующих компонентов в любую заданную позицию молекулы ДНК с сохранением ее способности к специфическим взаимодействиям, что может быть использовано для повышения функциональности ДНК-структур;
• открыты и описаны функции многих ДНК-зависимых ферментов, использование которых может быть полезно как при конструировании ДНК-объектов (например, использование ДНК-лигаз для сшивания «строительных блоков» в более сложно организованные структуры), так и при доказательстве их структуры и удалении побочных продуктов (например, нуклеазы);
• созданные на основе биологических молекул объекты обладают рядом уникальных свойств (биосовместимость и биодеградация), что открывает перспективы для их практического применения в биологии, медицине и др.

Первоначально ДНК-нанотехнология основывалась на использовании в качестве «строительных блоков» нативных олигонуклеотидов и ДНК-дуплексов. Конструирование на основе исключительно нативных НК накладывает некоторые ограничения на форму получаемых объектов, поскольку двухцепочечная молекула (дцДНК) — жесткая, топологически линейная структура. Персистентная длина ДНК-полимера в зависимости от состава и ионной силы буферных растворов составляет ~ 25-100 нм.¹ Очевидно, что линейные молекулы ДНК не представляют особого интереса для организации разнообразных дву- и трехмерных объектов. Поэтому в качестве «строительных блоков» все чаще рассматривают ДНК-дуплексы, содержащие в своем составе дополнительные модифицированные элементы, которые придают молекулам дцДНК недостающую им гибкость.

В структурной ДНК-нанотехнологии можно выделить два основных направления — это конструирование статических нано- и микрообъектов и создание динамических структур (молекулярных машин), способных контролируемо изменять свою форму и особенности организации. По структуре статические ДНК-объекты классифицируют на дискретные (обособленные структуры фиксированного размера) и периодические протяженные структуры, сформированные в результате последовательного соединения одного и того же или нескольких мономерных блоков.

За последнее десятилетие опубликовано большое число оригинальных и  обзорных статей, освещающих многие аспекты  конструирования объектов на основе ДНК². В большинстве обзоров уделяется внимание лишь отдельным этапам построения ДНК-структур. В ряде работ представлены мономерные элементы, используемые в ДНК-наноархитектонике для формирования сложных ДНК-объектов; описаны полученные к настоящему времени дискретные и периодические статические ДНК-объекты, а также динамические молекулярные ДНК-машины; продемонстрированы примеры введения модифицированных остатков ненуклеотидной природы, позволяющие повысить как структурное, так и функциональное разнообразие ДНК-объектов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ДНК-НАНОТЕХНОЛОГИЙ

 

Несмотря на огромное разнообразие получаемых ДНК-наноструктур, большинство из них до сих пор служат решению демонстрационных задач, в том числе связанных с проявлением эстетических вкусов авторов. В литературе главным образом обсуждаются лишь перспективы практического применения ДНК-конструкций. Наибольший потенциал их применения, по мнению многих авторов, связан с возможностью получения гибридных конструкций, несущих помимо элементов на основе ДНК компоненты ненуклеотидной природы. Важной особенностью такого декорирования ДНК-структур является возможность размещения функциональных групп и элементов в строго заданных позициях относительно друг друга и поверхности самой структуры в целом. На настоящий момент предложено множество разнообразных способов модифицирования ДНК-объектов катионами металлов, наночастицами, квантовыми точками, белками и др.

Можно выделить несколько перспективных  направлений использования модифицированных ДНК-конструкций. Одно из них связано  с декорированием молекул ДНК  ионами или наночастицами металлов, т.е. с созданием ДНК-нанопроводов. Металлизация цепи ДНК была проведена в два этапа: молекулу ДНК фиксировали концами на двух золотых электродах; противоионы Na ⁺ , компенсирующие заряд ДНК, заменяли на Ag ⁺ , после чего НК-цепь полностью покрывали металлическим серебром в кислом растворе гидрохинона в условиях тусклого освещения.³ В дальнейшем металлизированные ДНК-фрагменты получали при обработке модифицированной ДНК, несущей альдегидные группировки, раствором AgNO₃ или реактивом Толленса (аммиачный раствор оксида серебра) с последующей обработкой AuSCN в гидрохиноне. Такие процедуры приводят к образованию НК-провода, полностью покрытого золотом.⁴ С помощью аналогичной методики проведена металлизация нуклеино-белковой нити (ДНК-RecA) и периодической ДНК-решетки. Длина нанопроводов, получаемых на основе ДНК, составляет несколько микрометров, диаметр ~ 50-100 нм.

Предложен и другой способ металлизации НК-аналогов, который заключается в создании правозакрученной спирали двумя цепями НК-подобных молекул вокруг центральной оси, сформированной из ионов металлов. В основе методики лежит способность катионов металлов образовывать координационные соединения (комплексы). Например, ионы Cu²⁺ и Hg²⁺ способны давать стабильные комплексы с двумя молекулами 3-гидрокси-2-метилпиридин-4(1H)-она и пиридина соответственно. Аналоги нуклеиновых кислот, содержащие вместо гетероциклических оснований один из таких лигандов или их комбинацию, при введении в раствор Cu²⁺ и (или) Hg²⁺ образуют модифицированный ДНК-дуплекс вокруг оси, насыщенной ионами металлов. Вместо водородных связей такой дуплекс стабилизируется благодаря координационным взаимодействиям.⁵   Потенциальное применение ДНК-наноконструкций связывают с возможностью размещения на их поверхности различных биомолекул — НК-фрагментов или белков. Способы введения подобных компонентов основаны на использовании комплементарного распознавания, специфических взаимодействий антиген-антитело или биотин-стрептавидин, НК-аптамеров, а также на формировании ковалентных сшивок с помощью бифункциональных линкеров. Двумерные ДНК-плитки с размещенными на них в строгом порядке фрагментами НК могут быть использованы в качестве наноразмерных аналогов ДНК-чипов. Была получена ДНК-плитка размерами 90х60 нм, содержащая в определенных позициях поверхности олигонуклеотидные фрагменты, соответствующие трем генам — Rag-1, c-myc, β-actin. Добавление в раствор соответствующих РНК-мишеней, комплементарных данным участкам генов, приводит к формированию гибридизационных комплексов, которые можно детектировать с помощью анализа поверхности ДНК-плитки методом атомно-силовой микроскопии.⁶ Отмечаются некоторые ограничения в использовании подобных ДНК-чипов. Наиболее значимое из них — высокая плотность размещения специфических зон на поверхности наночипа с большим количеством НК-зондов. Например, было отмечено, что стерические препятствия и электростатические отталкивания НК-фрагментов на поверхности плитки могут снижать эффективность захвата мишени НК-зондами, располагающимися ближе к центру сенсорной конструкции.

На основе периодической ДНК-решетки  был получен ДНК-чип для одновременного детектирования нуклеиновых кислот, белков и других органических молекул  в многокомпонентных системах.⁷ ДНК-Чип был сконструирован на основе трех блоков: блоки А1 и А2 были модифицированы органическими красителями Су5 и Red-X соответственно, блок B содержал одноцепочечный участок-сенсор, образующий сигнальный комплекс с комплементарным олигонуклеотидом, меченным флуоресцентным красителем Fluor 488. Данный участок в свободном состоянии представляет собой зонд, специфично взаимодействующий с белком либо органической молекулой или же комплементарный определенному участку гена. При добавлении к ДНК-чипу соответствующих молекул-мишеней формируется комплекс, а сигнальный олигонуклеотид, содержащий флуорофор, вытесняется. Наличие выявляемых молекул детектируется по снижению интенсивности флуоресценции специфических зон чипа. Возможность выявления сразу нескольких мишеней была реализована с помощью двух типов красителей, присоединенных к блокам А1 и А2. При сборке ДНК-чипа составные блоки смешиваются в соотношении (А1 + А2): В = 1:1, однако построение непосредственно ДНК-чипа для выявления нескольких типов молекул осуществляется на основе нескольких мономерных ДНК-решеток, каждая из которых содержит блоки А1 и А2, взятые в строго определенном соотношении, и специфические блоки В-типа, несущие заданный зонд. Следовательно, ДНК-решетки для выявления разных молекул имеют характерную отличающуюся окраску, изменяющуюся определенным образом при формировании комплекса зонд-мишень. Количество выявляемых мишеней в одной системе определяется чувствительностью флуоресцентного детектора. Данная концепция была протестирована для выявления четырех резко различающихся по типу мишеней: ДНК двух вирусов (вируса иммунодефицита человека и вируса тяжелого острого респираторного синдрома), белка a-тромбина человека и аденозинтрифосфата.

Размещение на поверхности одной  ДНК-структуры разных белковых молекул открывает перспективы получения так называемых нанофабрик. Возможность сближения на ДНК-плитке нескольких участвующих в серии последовательных превращений ферментов может привести к ускорению мультиферментных реакций, лимитирующей стадией которых является диффузия субстратов.⁸ На молекуле ДНК с использованием высокоспецифичного биотин-стрептавидиного взаимодействия фиксировали ферменты оксидоредуктазу и люциферазу, катализирующие две сопряженные реакции. Эффективность превращения субстрата в таком комплексе была, по крайней мере, в два раза выше, чем в случае одновременного присутствия таких ферментов в растворе. Ведь даже простое сближение в пространстве двух и более органических молекул, используя присоединенные к ним комплементарные олигонуклеотиды, может приводить к ускорению реакции между реагентами за счет изменения характера реакции на псевдовнутримолекулярный.⁹

Особые надежды в получении  нанофабрик связывают с внедрением в качестве платформы для их построения структуры типа ДНК-оригами. В этих мультимолекулярных ассоциатах имеется возможность модифицировать большое число формирующих их компонентов, при этом функционализация определенного компонента задает позицию данной функции на поверхности формируемой конструкции, а также взаимное расположение функций.

Трехмерные ДНК-структуры (ДНК-многогранники  и оригами-коробочки) рассматриваются  в качестве возможных кандидатов для капсулирования и транспортировки разнообразных молекул — разработаны способы упаковки внутри подобных структур молекул белков или наночастиц.¹⁰ Важной особенностью подобных ДНК-объектов является то, что, с одной стороны, они обладают структурной стабильностью, с другой — могут быть открыты за счет биодеградации стенок при воздействии нуклеаз или в присутствии в растворе специфических сигнальных молекул.¹¹

Было продемонстрировано конструирование  ДНК-тетраэдра, форма которого изменяется в ответ на присутствие в растворе определенной нуклеотидной последовательности. Для этого в одно из его ребер  вводят петлю, раскрывающуюся и формирующую  комплементарный комплекс при добавлении в систему соответствующего олигонуклеотида. В результате при увеличении одного из ребер ДНК-многогранника увеличивается площадь одной из его граней, что может приводить к высвобождению молекул, переносимых внутри подобного ДНК-контейнера. Была разработана технология конструирования по принципу оригами ДНК-контейнера, оборудованного «замком», открывающимся в ответ на присутствие в системе олигонуклеотидного «ключа».¹² Таким образом, трехмерные ДНК-структуры могут быть использованы для защиты и транспортировки специфических молекул, в том числе адресованных внутрь клеток.

Возможность организации молекул  строго определенным образом на поверхности ДНК-объекта может быть использована для исследования их свойств. Например, расположив наночастицы металлов на ДНК-решетке, где четко задается расстояние между модифицированными сайтами, можно исследовать их оптические, электронные и каталитические характеристики. Уникальная форма ДНК-нанотрубок позволяет применять их для своего рода упаковки и последующего структурного исследования с помощью спектроскопии ЯМР трансмембранных белков.¹³

На примере молекулы ДНК и  двумерной ДНК-решетки показана возможность использования структур на основе ДНК в качестве матриц для молекулярной литографии. Для  этого нанесенные на поверхность  слюды ДНК-объекты покрывали золотой  пленкой толщиной в 20 нм, затем металлическую пленку приклеивали к стеклянной пластинке. После разделения такой сэндвич-структуры на внешней поверхности золотой пленки, оставшейся на стекле, наблюдали негативное изображение ДНК-решетки, сформированной изначально на слюде.

Еще одна из потенциально важных областей применения ДНК-наноструктур, а именно дву- и трехмерных решеток, связана с получением на их основе молекулярных сит или молекулярных фильтров. Была продемонстрирована способность трехмерных ДНК-решеток с внутренними порами ~9 нм адсорбировать молекулы белков. В этих экспериментах ДНК-решетки обрабатывали набором отрицательно заряженных ионов при нейтральных pH белков с различной молекулярной массой. После продолжительной инкубации ДНК- решетки отмывали и исследовали состав белков, связавшихся с ДНК-конструкцией. Было показано, что с ДНК- решеткой связываются только белки с молекулярной массой <45 кДа.

В литературе представлено немало разработок для активного внедрения получаемых ДНК-наноструктур в разнообразных практических областях: электронике, медицине, наномеханических системах и др. Однако до настоящего времени нет работ по использованию конструкций на основе ДНК на практике, они до сих пор остаются лишь перспективными элементами молекулярных инструментов и техники будущего.

 

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАЯ СТРУКТУРЫ ДНК-НАНООБЪЕКТОВ

 

Для первичной характеристики мономерных ДНК-блоков или более сложных ассоциатов довольно часто используют непрямые методы установления структуры объектов. Чтобы экспресс-анализ был возможен, в структуре блоков или конечных собранных объектов размещают, например, определенные ДНК-фрагменты, являющиеся сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции. «Меченные» таким образом ДНК-структуры способны расщепляться, давая прогнозируемый набор продуктов, указывающий на качество сборки. Пошаговую сборку ДНК-структуры легко контролировать методом задержки в геле, позволяющим зафиксировать изменение размера и (или) формы продукта ассоциации.¹⁴

Кроме того, для исследования ДНК-объектов часто используют методы, связанные с предварительным модифицированием ДНК-структур. Например, введение молекул-флуорофоров позволяет получить изображение объектов с помощью флуоресцентных микроскопов, что в основном и применяют для характеризации периодических ДНК-матриц. Мечение определенных олигонуклеотидных компонентов двумя флуоресцентными красителями позволяет определить степень их сближения в получаемом ДНК-объекте за счет исследования эффективности резонансного переноса энергии флуоресценции. Подобная методика описана для косвенного доказательства строения плоского ДНК-многоугольника и периодических ДНК-матриц.¹⁵

Точное установление структуры  и формы ДНК-объекта возможно только с использованием более сложного инструментария. Одним из наиболее распространенных методов доказательства строения нанообъектов является атомно-силовая микроскопия (АСМ). Именно с ее помощью

 

Рис. 1. Типичные изображения, полученные при исследовании ДНК-объектов методами атомно-силовой (а-f) и криоэлектронной микроскопии (g): ДНК-многоугольники на основе 40А-блоков (а-с), периодические матрицы, сформированные на основе 5DA- блоков (d, е), ДНК-тетраэдры на основе 3DA-блоков (f, g). Размер области сканирования: 500 х 500 нм (а), 1000 х 1000 нм (b), 200 х 200 нм (с).

 

получены  изображения и размерные характеристики подавляющего большинства описанных нано- и микроразмерных ДНК-структур (рис. 24). Однако метод АСМ не всегда применим для исследования объемных структур, конструируемых на основе биологических молекул. Было показано, что для изучения пространственной организации трехмерных ДНК-объектов, например многогранников, более информативен метод криоэлектронной микроскопии (см. рис. 1). Помимо этого, описан способ исследования строения трехмерных ДНК-нанотрубок с помощью электронной микроскопии. Однако в этом случае требуется введение в структуру ДНК-объекта наночастиц металлов, обеспечивающих контрастность изображения. С помощью электронной микроскопии было доказано строение трехмерной оригами-структуры.¹⁶

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Структурную ДНК-нанотехнологию, безусловно, можно назвать новой главой в истории молекулы ДНК. Подход к конструированию нанообъектов «снизу вверх», применяемый в ДНК-нанотехнологии, позволяет получать на основе простых линейных молекул ДНК сложные по форме объекты, а порой и своего рода архитектурные ансамбли. Используя исключительно уотсон-криковские взаимодействия для организации мономерных блоков, возможно построение статических и динамических, дискретных и периодических, одно-, дву- и трехмерных ДНК-структур. Успех в получении разнообразных объектов в очередной раз говорит в пользу ДНК как идеального «строительного блока» для конструирования объектов в нанометровом диапазоне. Для придания уникальных свойств и расширения возможностей структурной ДНК-нанотехнологии в состав НК-блоков часто вводят дополнительные конструкционные элементы: белки, остатки органических молекул.

Большое разнообразие форм получаемых объектов и возможность декорирования  составных олигонуклеотидов без изменения их способности к самоассоциации открывают удивительные перспективы для будущего практического применения ДНК-наноструктур. Основные направления развития ДНК-нанотехнологии связывают с получением контейнеров для транспортировки и матриц для организации биомолекул, конструированием платформ для медицинской диагностики и компонентов микро- и наноэлектроники.

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. C.G.Baumann, S.B.Smith, V.A.Bloomfield, C.Bustamante. Proc. Natl. Асаd. Sci. USA, 94, 6185 (1997)

2. J.Wengel. Org. Biomol. Chem., 2, 277 (2004)

3. E.Braun, Y.Eichen, U.Sivan, G.Ben-Yoseph. Nature (London), 391, 775 (1998)

4. M.Fischler, U.Simon, H.Nir, Y.Eichen, G.A.Burley, J.Gierlich, P.M.E.Gramlich, T.Carell. Small, 3, 1049 (2007)

5. K.Tanaka, G.H.Clever, Y.Takezawa, Y.Yamada, C.Kaul, M.Shionoya, T.Carell. Nat. Nanotechnol., 1, 190 (2006)

6. Y.Ke, S.Lindsay, Y.Chang, Y.Liu, H.Yan. Science, 319, 180 (2008)

7. C.Lin, Y.Liu, H.Yan. Nano Lett, 7, 507 (2007)

8. C.M.Niemeyer, J.Koehler, C.Wuerdemann. ChemBioChem., 3, 242 (2002)

9. K.V.Gothelf, R.S.Brown. Chem.-Eur. J., 11, 1062 (2005)

10. C.M.Erben, R.P.Goodman, A.J.Turberfield. Angew. Chem., Int. Ed, 45, 7414 (2006)

11. L.Feng, S.H.Park, J.H.Reif, H.Yan. Angew. Chem., Int. Ed., 42, 4342 (2003)

12. E.S.Andersen, M.Dong, M.M.Nielsen, K.Jahn, R.Subramani, W.Mamdouh, M.M.Golas, B.Sander, H.Stark, C.L.P.Oliveira, J.S.Pedersen, V.Birkedal, F.Besenbacher, K.V.Gothelf, J.Kjems. Nature (London), 459, 73 (2009)

13. S.M.Douglas, J.J.Chou, W.M.Shih. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 6644 (2007)

14. E.Winfree, F.Liu, L.A.Wenzler, N.C.Seeman. Nature (London), 394, 539 (1998)

15. B.Sacca, R.Meyer, U.Feldkamp, H.Schroeder, C.M.Niemeyer. Angew. Chem., Int. Ed., 47, 2135 (2008)

16. D.Han, S.Pal, J.Nangreave, Z.Deng, Y.Liu, H.Yan. Science, 332, 342(2011)

¹ C.G.Baumann, S.B.Smith, V.A.Bloomfield, C.Bustamante. Proc. Natl. Асаd. Sci. USA, 94, 6185 (1997)

² J.Wengel. Org. Biomol. Chem., 2, 277 (2004)

³ E.Braun, Y.Eichen, U.Sivan, G.Ben-Yoseph. Nature (London), 391, 775 (1998)

⁴ M.Fischler, U.Simon, H.Nir, Y.Eichen, G.A.Burley, J.Gierlich, P.M.E.Gramlich, T.Carell. Small, 3, 1049 (2007)

⁵ K.Tanaka, G.H.Clever, Y.Takezawa, Y.Yamada, C.Kaul, M.Shionoya, T.Carell. Nat. Nanotechnol., 1, 190 (2006)

⁶ Y.Ke, S.Lindsay, Y.Chang, Y.Liu, H.Yan. Science, 319, 180 (2008)

⁷ C.Lin, Y.Liu, H.Yan. Nano Lett, 7, 507 (2007)

⁸ C.M.Niemeyer, J.Koehler, C.Wuerdemann. ChemBioChem., 3, 242 (2002)

⁹ K.V.Gothelf, R.S.Brown. Chem.-Eur. J., 11, 1062 (2005)

¹⁰ C.M.Erben, R.P.Goodman, A.J.Turberfield. Angew. Chem., Int. Ed, 45, 7414 (2006)

¹¹ L.Feng, S.H.Park, J.H.Reif, H.Yan. Angew. Chem., Int. Ed., 42, 4342 (2003)

¹² E.S.Andersen, M.Dong, M.M.Nielsen, K.Jahn, R.Subramani, W.Mamdouh, M.M.Golas, B.Sander, H.Stark, C.L.P.Oliveira, J.S.Pedersen, V.Birkedal, F.Besenbacher, K.V.Gothelf, J.Kjems. Nature (London), 459, 73 (2009)

¹³ S.M.Douglas, J.J.Chou, W.M.Shih. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 6644 (2007)

¹⁴ E.Winfree, F.Liu, L.A.Wenzler, N.C.Seeman. Nature (London), 394, 539 (1998)

¹⁵ B.Sacca, R.Meyer, U.Feldkamp, H.Schroeder, C.M.Niemeyer. Angew. Chem., Int. Ed., 47, 2135 (2008)

¹⁶ D.Han, S.Pal, J.Nangreave, Z.Deng, Y.Liu, H.Yan. Science, 332, 342 (2011)