Количественное определение флавоноидов и фенолокислот в надземной части соссюреи спорной

Государственное бюджетное образовательное  учреждение

высшего профессионального образования

«Сибирский государственный медицинский  университет»

Министерства здравоохранения  и социального развития Российской Федерации

(ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития  России)

Фармацевтический факультет

Кафедра  фармацевтической химии

Сертификационная работа

Количественное определение  флавоноидов и фенолокислот в надземной части соссюреи спорной

Специальность «фармация»

Зав. кафедрой, д.ф.н.,

профессор___________Ермилова Е.В.

Руководитель, ст. препод.,

к.ф.н. ___________ Авдеева Е.Ю.

Интерн _____________Соколова С.Н.

Томск  - 2012   

 Содержание

Содержание 2

Введение 3

1. Разработка методики определения флавоноидов в надземной части соссюреи спорной 4

1.1. Определение оптимальных  условий экстракции рутина из надземной части соссюреи спорной 6

1.1.1 Выбор оптимальной концентрации этанола 6

1.1.2. Определение оптимального соотношения сырье-экстрагент и кратности экстракции 6

1.1.3. Определение времени экстракции 7

1.1.4. Отработка условий проведения реакции 7

1.2. Определение содержания рутина в надземной части соссюреи спорной 8

1.3. Определение оптимальных условий экстракции гликозидов кверцетина в надземной части соссюреи спорной 10

1.3.1 Выбор оптимальной концентрации этанола 10

1.3.2 Отработка условий проведения гидролиза 10

1.3.3. Определение времени гидролиза 11

1.3.4. Отработка условий проведения реакции 12

1.4. Определение содержания гликозидов кверцетина в надземной части соссюреи спорной 13

2.Определение фенолокислот в надземной части соссюреи спорной. 14

2.1. Выбор оптимальной концентрации этанола 14

2.2. Определение содержания фенолокислот в надземной части 15

соссюреи спорной 15

Выводы 17

Список литературы 18

Введение

Известно, что в последние годы значительно возрос интерес к  препаратам растительного происхождения, и в современной медицине всё  более пристальное внимание учёных привлекают к себе лекарственные  растения. С каждым годом увеличивается  ассортимент фитопрепаратов, что  связано с их комплексным воздействием на организм, более мягким действием, меньшей токсичностью, чем у синтетических  средств, и возможностью длительного  применения без проявления побочных эффектов. В настоящее время многие растения, в том числе и представители  рода Saussurea, целебные свойства которых издавна используются народами мира для лечения различных заболеваний, остаются недостаточно изученными, что ограничивает их применение в официнальной медицине. В связи с этим одним из приоритетных направлений научных исследований является изучение химического состава растений, находящих широкое применение в народной медицине, выделение из них биологически активных веществ (БАВ) и разработка на их основе высокоэффективных лекарственных средств (ЛС).

В последние десятилетия возрос интерес к изучению химического  состава, и количественного содержания БАВ растений рода Saussurea [21], что свидетельствует о значительных потенциальных возможностях этих растений. Нами для исследования была выбрана соссюрея спорная (Saussurea controversa DC). Ранее в результате изучения химического состава надземной части растения нами обнаружены кумарины, флавонолы (кверцетин, кемпферол), флавонолгликозиды (в гидролизате кверцетин, кемпферол, мирицетин, D-глюкоза, D-галактоза), фенолокислоты, полисахариды, аминокислоты, конденсируемые дубильные вещества, выделены D-ксилоза, кверцетин, кемпферол, рутин,кверцетин-3,5-глюкоарабинозид, кофейная кислота и эскулетин.

Цель настоящей работы – количественное определение флавоноидов и гидроксикоричных кислот в надземной части соссюреи спорной.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить оптимальные условия экстракции флавоноидов и фенолокислот из надземной части соссюреи спорной.
2. Разработать методики количественного определения флавоноидов и фенолокислот из растения.
3. Определить сумму флавоноидов и гидроксикоричных кислот в растении.

Сертификационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармацевтической химии ГОУ ВПО Сибирского государственного медицинского университета Минздравсоцразвития России.

1. Разработка методики определения флавоноидов в надземной части соссюреи спорной

В исследованиях использовали надземную часть соссюреи спорной, собранную в Иркутской обл., в окрестностях п. Кочергат, в 2008-2010 г.

Определение содержания флавоноидов  проводили с использованием метода дифференциальной спектрофотометрии. Разработанная методика для определения флавоноидов по рутину основана на экстракции их из сырья водным этанолом с последующим проведением реакции комплексообразования с алюминия хлоридом в кислой среде. Ранее, исследования химического состава надземной части соссюреи спорной показали, что растение кроме рутина содержит другие гликозиды кверцетина. В связи с этим целесообразно определить их количественное содержание. Для этого полученный экстракт подвергали кислотному гидролизу. В качестве раствора сравнения использовали испытуемое извлечение в первом случае и гидролизат во втором без реактива, что позволило исключить влияние сопутствующих веществ, имеющих максимум поглощения в области аналитической длины волны, на результаты анализа.

Для определения аналитической  длины волны изучены УФ-спектры  Государственного стандартного образца (ГСО) рутина, кверцетина, и полученных водно-спиртовых экстрактов, а также продуктов кислотного гидролиза (ПКГ) спиртовых извлечений из надземной части соссюреи спорной. Максимум поглощения ГСО рутина после реакции комплексообразования находится в области 410 нм, и соотносится с максимумом поглощения водно-спиртового экстракта соссюреи спорной в определенной концентрации, что позволяет использовать данную длину волны в качестве аналитической для количественного определения содержания флавоноидов (рис. 1).

400

300

200

1

2

Рис. 1. УФ-спектры растворов ГСО рутина(1) и экстракта из надземной части соссюреи спорной на 70% этаноле(2) с 5% раствором AlCl₃.

Максимум поглощения кверцетина после реакции комплексообразования с раствором алюминия хлорида находится в области 425 нм и совпадает с таковым дифференциальной кривой ПКГ соссюреи спорной, что дает возможность использовать длину волны при 425 нм в качестве аналитической (рис.2).

400

300

200

1

2

Рис. 2. УФ-спектры  растворов ГСО кверцетина (1) и ПКГ экстракта из надземной части соссюреи спорной на 40% этаноле(2) с 5% раствором AlCl₃.

Следует отметить, что спектрофотметрические  характеристики 40% и 70% этанольного экстракта соссюреи спорной в диапазоне используемых концентраций подчиняются закону Бугера-Ламберта-Бера (рис.3).

Рис. 3. График зависимости изменения оптической плотности от количества экстракта из надземной части соссюреи спорной.

1.1. Определение оптимальных  условий экстракции рутина из надземной части соссюреи спорной

1.1.1 Выбор оптимальной концентрации этанола

Для проведения исследования готовили три пробы: по 1,0 г сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм помещали в колбы со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагировали этанолом различной концентрации (20, 40, 70 и 95% соответственно) трижды по 30 мин на водяной бане при температуре 80 °С. Извлечения объединяли и фильтровали через бумажный фильтр («Красная лента») в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводили соответствующим этанолом до метки (раствор А). 5 мл раствора А (аликвота) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 410 нм через 60 мин.

В соответствии с результатами измерений, оптимальной  для извлечения рутина из надземной части соссюреи спорной является концентрация этанола 70% (табл. 1).

Таблица 1 – Зависимость содержания флавоноидов в экстракте соссюреи спорной от концентрации этанола

1.1.2. Определение оптимального соотношения сырье-экстрагент и кратности экстракции

В связи  с тем, что объем получаемого  экстракта по условию ограничен колбой на 100 мл, то исследованию подвергались условия: двухкратная экстракция в соотношении сырье : экстрагент 1 : 45 и трехкратная экстракция в соотношении 1 : 30. Раствор А получали как указано выше, экстрагируя 70% этанолом, с использованием различного соотношения сырья и экстрагента (1:30, 1:45). 5 мл раствора А помещали в колбу вместимостью 25 мл, добавляли 3 мл 5% раствора алюминия хлорида, 0,1 мл хлористоводородный кислоты и доводили 95% этанолом до метки, по истечении 60 мин измеряли оптическую плотность образцов. Оптимальным является соотношение 1:30 (табл.2).

Таблица 2 – Зависимость содержания флавоноидов в экстракте соссюреи спорной от соотношения сырья и экстрагента

1.1.3. Определение времени экстракции

Испытуемые  образцы получали как описано  выше, используя в качестве экстрагента 70% водный этанол в соотношении 1:30, экстрагируя трехкратно, варьируя время экстракции (15, 30, 45 и 60 мин). 5 мл раствора А помещали в колбу вместимостью 25 мл, добавляли 3 мл 5% раствора алюминия хлорида, 0,1 мл хлористоводородный кислоты и доводили 95% этанолом до метки, по истечении 60 мин измеряли оптическую плотность образцов. Результаты измерений представлены в таблице 3. Оптимальное время экстракции составляет 45 мин.

Таблица 3 – Зависимость содержания флавоноидов в экстракте соссюреи спорной от времени экстракции

Таким образом, оптимальными условиями экстрагирования  являются: трехкратная экстракция 70% этанолом в соотношении 1:30 в течение 45 мин при температуре 80°С.

1.1.4. Отработка условий проведения реакции

Приготовление раствора А осуществляли в соответствии с методикой указанной  выше.

Для выбора количества добавляемого реактива в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 5 мл (аликвота) раствора А, 5% этанольный раствор алюминия хлорида  в количестве 1, 3, 5 и 7 мл, доводили 95% этанолом до метки и 0,1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 410 нм через 60 мин.  (табл. 4).

Таблица 4 –  Зависимость величины оптической плотности  от количества 5% раствора алюминия хлорида

Для определения количества добавляемой  концентрированной хлористоводородной кислоты в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 5 мл раствора А, 5 мл 5% этанольного  раствора алюминия хлорида, концентрированной  хлористоводородной кислоты в количестве 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 мл и доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 410 нм (табл. 5).

Таблица 5 – Зависимость  величины оптической плотности от количества концентрированной хлористоводородной кислоты

Для определения времени реакции  в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 5 мл (аликвота) раствора А, 5 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, 0,3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 410 нм через 30, 45, 60, 90 и 120 мин. Результаты показали, что оптимальным является время реакции 60 мин.

Таким образом, для полного проведения реакции необходимо вносить 5 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида и 0,3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Время проведения реакции 60 мин.

1.2. Определение содержания рутина в надземной части соссюреи спорной

Определение рутина осуществляли по разработанной нижеизложенной методике.

Методика определения. Аналитическую пробу сырья массой 1,0 г (т.н.), измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2-3 мм помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагируют 70% этанолом трижды по 45 мин на водяной бане при температуре 80 °С. Извлечения объединяют и фильтруют через бумажный фильтр («Красная лента») в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 70% этанолом до метки (раствор А). 5 мл (аликвота) полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 5 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, 0,3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при l 410 нм через 60 мин. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца рутина. Для этого 1 мл 0,02% раствора рутина-стандарта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл 5% раствора алюминия хлорида, 0,3 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят до метки 95% этанолом.

Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина: 0,0050 г (точная навеска) ГСО рутина, высушенного до постоянной массы при температуре 100-105 °С, растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в небольшом количестве подогретого 95% спирта этилового и доводят объем раствора тем же спиртом до метки.

Расчет  процентного содержания флавоноидов  в пересчете на рутин осуществляют по формуле:

Х _{(%)  =} D · Mо · 100 · 25 · 1 · 100 · 100 ₌ D · Mо · 8000   ,

                 Dо · М · 5 · 25 · 25 · (100-W)             Dо · М · (100-W)

где  D- оптическая плотность испытуемого раствора;

Dо- оптическая плотность ГСО рутина (среднее из трех измерений), равная 0,243;

Mо- масса ГСО рутина, г;

М- масса  навески сырья, г;

W- влажность, %.

Результаты измерений представлены в таблице 7.

Таблица 6 – Содержания флавоноидов в экстракте из надземной части соссюреи спорной разного года сбора.

1.3. Определение оптимальных условий экстракции гликозидов кверцетина в надземной части соссюреи спорной

1.3.1 Выбор оптимальной концентрации этанола

Для проведения исследования готовили три пробы: по 1,0 г сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм помещали в колбы со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагировали этанолом различной концентрации (20, 40, 70 и 90% соответственно) трижды по 30 мин на водяной бане при температуре 80 °С. Извлечения объединяли и фильтровали через бумажный фильтр («Красная лента») в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводили соответствующим этанолом до метки (раствор А). 20 мл раствора А помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляли 3% концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течениие 2 ч. 1 мл раствора прогидролизованного раствора А (аликвота) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляли 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 50 мин. В соответствии с результатами измерений, оптимальной для извлечения флавонолгликозидов из надземной части соссюреи спорной является концентрация этанола 40% (табл. 7). Что согласуется с ранее проведенными исследованиями, указывающими на гидрофильный характер гликозидов кверцетина соссюреи спорной.

Таблица 7 – Зависимость оптической плотности в экстракте соссюреи спорной от концентрации этанола

1.3.2 Отработка условий проведения гидролиза

Приготовление раствора А проводили по описанной выше методике. 20,0 мл раствора А помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, добавляли 1% концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 ч. Аналогичным образом осуществляли гидролиз раствора А с добавлением 3, 5, 7 и 9% концентрированной хлористоводородной кислоты. В колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл (аликвота) прогидролизованного раствора А, добавляли 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 60 мин (табл. 8). В соответствии с результатами измерений для проведения гидролиза оптимально добавлять 3% концентрированной хлористоводородной кислоты.

Таблица 8 – Зависимость величины оптической плотности от количества хлористоводородной кислоты, используемой при гидролизе этанольного извлечения соссюреи спорной

1.3.3. Определение времени гидролиза

 Для определения времени  гидролиза 20,0 мл раствора А  помещали в колбу со шлифом  вместимостью 100 мл, прибавляли 3% концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Аналогичным образом осуществляли гидролиз в течение 60, 90, 120 и 150 мин. В колбу вместимостью 25 мл помещали 1 мл (аликвота) прогидролизованного раствора А, добавляли 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 60 мин. (табл. 9). 

Таблица 9 – Зависимость величины оптической плотности от времени проведения гидролиза этанольного извлечения соссюреи спорной

Исходя  из результатов эксперимента, гидролиз проходит полностью при добавлении 3% концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревании на кипящей  водяной бане в течение 120 мин.

1.3.4. Отработка условий проведения реакции

Приготовление раствора А и его  гидролиз осуществляли в соответствии с методикой указанной выше.

Для выбора количества добавляемого реактива в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 1 мл (аликвота) прогидролизованного  раствора А, 5% этанольный раствор алюминия хлорида в количестве 1, 2, 3, 4 и 5 мл, доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 60 мин.  (табл. 10).

Таблица 10 – Зависимость величины оптической плотности от количества 5% раствора алюминия хлорида

Для определения времени реакции  в мерную колбу емкостью 25 мл помещали 1 мл (аликвота) прогидролизованного  раствора А, 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида и доводили 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре «СФ2000» при l 430 нм через 10, 20, 30, 40, 45, 50, 60, и 70 мин (рис. 4).

Рис 4 Зависимость величины оптической плотности от времени проведения реакции.

Таким образом, для полного проведения реакции необходимо вносить 3 мл 5% этанольного  раствора алюминия хлорида. Время проведения реакции 50 мин.

1.4. Определение содержания гликозидов кверцетина в надземной части соссюреи спорной

Определение содержания гликозидов кверцетина проводили  по разработанной нижеизложенной методики.

Методика определения. Аналитическую пробу сырья массой 1,0 г (т.н.), измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2-3 мм помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, экстрагируют 40% этанолом трижды по 45 мин на водяной бане при температуре 80 °С. Извлечения объединяют и фильтруют через бумажный фильтр («Красная лента») в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 40% этанолом до метки (раствор А). 20 мл раствора А помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 3% конц. хлористоводородной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 120 мин. 1 мл (аликвота) полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 3 мл 5% этанольного раствора алюминия хлорида и доводят 95% этанолом до метки. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при l 425 нм через 50 мин. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца кверцетина. Для этого 1 мл 0,02% раствора кверцетин-стандарта помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 3 мл 5% раствора алюминия хлорида и доводят до метки 95% этанолом.

Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) кверцетина: 0,0050 г (точная навеска) ГСО кверцетина, высушенного до постоянной массы при температуре 100-105 °С, растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в небольшом количестве подогретого 95% спирта этилового, прибавляют 1 каплю концентрированной хлористоводородной кислоты и доводят объем раствора тем же спиртом до метки.

Результаты измерений представлены в таблице 11.

Расчет  процентного содержания флавоноидов  в пересчете на кверцетин осуществляли по формуле:

Х _{(%)  =} D · Mо · 100 · 25 · 1 · 100 · 100 ₌ D · Mо · 40000   ,

                 Dо · М · 1· 25 · 25 · (100-W)             Dо · М · (100-W)

где  D- оптическая плотность испытуемого раствора;